Development of liposomal formulations of Moxifloxacin for intraocular administration for the therapy/prevention of post-operative endophthalmitis

Abstract

Postoperative endophthalmitis is a common severe intraocular infection, which, when remaining incurable, can lead to permanent loss of vision. The past few years, several antibiotics have been utilized for treatment or prophylaxis of/from post-cataract-surgery endophthalmitis, and one of them is the fourth-generation fluoroquinolone antibiotic moxifloxacin (MOX). MOX is mainly administered as a solution topically, on the eye surface in the form of drops, however, because of its limited residence time in the area and low permeability through the several ocular barriers of the eye, and consequently the low bioavailability in the posterior part of the eye, its action is limited, leading to short protection and the need for daily dose repetitions. The development of innovative intravitreal injection forms that release MOX in a controlled manner will have a major impact on the treatment as well as the prevention of severe postoperative infections. Among the advanced carriers of drugs, liposomes are the most biocompatible and non-toxic that offer increased drug incorporation, prolongation of drug action time (controlled release rate), ability to target specific cells, protection of active ingredients, ability to overcome biological barriers, etc. In the present thesis, we aimed to develop optimal sustained release MOX loaded liposomes, as intraocular therapeutic agents for endophthalmitis. Three methods were used for the preparation of MOX loaded liposomes, the passive loading Dehydration-Rehydration (DRV) method and two active loading liposome preparation methods; the “conventional” Active or Remote Loading method (AL) and a newly developed herein method comprising alternative Microfluidic mixing cycles (MF).Numerous lipid-membrane compositions were used to determine potential effect on MOX loading and retention in liposomes, while the different preparation methods were also compared in regards to their antibacterial effects against S. Epidermidis and S. aureus bacterial strains, in planctonic bacteria as well as in biofilms.The active loading methods conferred liposomes with higher MOX encapsulation compared to the DRV method, for all the lipid compositions used, while they also demonstrated substantially higher antimicrobial potential towards S. epidermidis growth and biofilm susceptibility, compared to corresponding DRV liposomes, indicating the importance of sustained MOX retention into liposomes, on their activity. Additionally, Cholesterol (Chol) incorporation into the liposome membrane is demonstrated to be a key factor, influencing the antimicrobial efficacy of liposomal MOX towards S. epidermidis and S. aureus bacterial strains. Furthermore, interestingly, the lipid amount that carries a given amount of MOX was also found to have a significant effect on MOX-liposome antimicrobial activity, suggesting that as the number of MOX-loaded vesicles that come into contact with bacteria increases, so does the overall antimicrobial effect.Concluding, the liposome preparation method/type, the lipid concentration that is incubated with the bacteria (and thereby the number of vesicles/nanoparticles that interacts with a given number of bacterial cells), and also the Chol molar ratio of liposomal MOX, determine the antibacterial properties of MOX-loaded liposomes towards planktonic bacteria and also towards biofilm-forming ones, possibly due to the different percent of MOX retention in the liposomes under the different conditions applying. The current findings are particularly interesting and deserve further in vitro and in vivo investigations.

Η μετεγχειρητική ενδοφθαλμίτιδα είναι μια σοβαρή οφθαλμική λοίμωξη, η οποία όταν παραμένει αθεράπευτη μπορεί να οδηγήσει σε τύφλωση. Τα τελευταία χρόνια, αρκετά αντιβιοτικά χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία/πρόληψη της ενδοφθαλμίτιδας, ένα από τα οποία είναι το αντιβιοτικό τέταρτης γενιάς, η Μοξιφλοξασίνη (ΜOΧ). Η MOX χορηγείται ως υδατικό διάλυμα, ωστόσο, λόγω του περιορισμένου χρόνου παραμονής του φαρμάκου στην περιοχή δράσης και της χαμηλής διαπερατότητάς του στο οπίσθιο τμήμα του οφθαλμού, η δράση του είναι περιορισμένη, οδηγώντας στην ανάγκη για καθημερινές επαναληπτικές χορηγήσεις. Η ανάπτυξη καινοτόμων μορφών MOX βραδείας αποδέσμευσης σχεδιασμένων για ενδοϋαλωειδική ένεση, θα έχει σημαντικό αντίκτυπο στη θεραπεία και την πρόληψη σοβαρών μετεγχειρητικών λοιμώξεων. Μεταξύ των προηγμένων φορέων φαρμάκων, τα λιποσώματα είναι τα πιο σημαντικά, καθώς παρουσιάζουν βιοσυμβατότητα, είναι μη τοξικά, και μπορούν να προσφέρουν αυξημένο εγκλωβισμό φαρμάκων σε σύγκριση με άλλους νανοφορείς, ελεγχόμενο ρυθμό απελευθέρωσης, ικανότητα στόχευσης συγκεκριμένων κυττάρων και ιστών, προστασία ενεργών συστατικών, ικανότητα υπέρβασης βιολογικών φραγμών κ.λπ. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη λιποσωμικών μορφών ΜOΧ βραδείας αποδέσμευσης για τη θεραπεία ή την πρόληψη της μετεγχειρητικής ενδοφθαλμίτιδας. Μελετήθηκαν τρεις διαφορετικές μέθοδοί παρασκευής λιποσωμικής ΜOΧ:(i) Η μέθοδος αφυδάτωσης-επανενυδάτωσης (DRV) και,(ii) Δύο μέθοδοι ενεργής φόρτωσης, η συμβατική μέθοδος Ενεργής Φόρτισης (AL), και μια νέα μέθοδος που αναπτύχτηκε στην παρούσα διατριβή με ανάμειξη με μεθόδους Μικρορροής (MF).Μελετήθηκαν 9-10 λιπιδικές συστάσεις για τον προσδιορισμό της πιθανής επίδρασης στον εγκλωβισμό και τη συγκράτηση της ΜOΧ στα λιποσώματα, ενώ οι διαφορετικές μέθοδοί παρασκευής μελετήθηκαν και ως προς την αντιβακτηριακή δράση των μορφών που παρήχθησαν έναντι του βακτηριακού στελέχους αναφοράς S. epidermidis καθώς και διάφορων νοσοκομειακών στελεχών.Στα λιποσώματα που παρασκευάστηκαν με τις μεθόδους ενεργής φόρτωσης παρατηρήθηκε αυξημένες εγκλωβισμός MOX σε σύγκριση με τη μέθοδο DRV, σε όλες τις λιπιδικές συνθέσεις που μελετήθηκαν, ενώ έδειξαν σημαντικά υψηλότερη αντιμικροβιακή δράση έναντι πλαγκτονικών βακτηρίων και βακτηρίων ενσωματωμένων σε βιομεμβράνη, υποδεικνύοντας τη σημασία του αργού ρυθμού απελευθέρωσης του MOX από τα λιποσώματα (που χαρακτήριζε τα συγκεκριμένα ειδη λιποσωμάτων). Επιπλέον, η παρουσία χοληστερόλης στη διπλοστιβάδα είναι ένας βασικός παράγοντας, που βρέθηκε επηρεάζει τη βακτηριοκτόνα δράση της λιποσωμικής MOX.Συμπερασματικά, η μέθοδος παρασκευής της λιποσωμικής ΜOΧ, η λιπιδική συγκέντρωση των λιποσωμάτων-MOX (δηλαδή ο αριθμός των κυστιδίων ή νανοσωματιδίων) που επωάζεται με τα βακτήρια, καθώς και η αναλογία της χοληστερόλης στη λιπιδική μεμβράνη των λιποσωμάτων ΜΟΧ, καθορίζουν το αντιμικροβιακό δυναμικό τους, πιθανώς λόγω του διαφορετικού ρυθμού απελευθέρωσης του MOX από τα διαφορετικά είδη λιποσώματων που οδηγεί σε τροποποίηση του μηχανισμού εισόδου ή/και αλληλεπίδρασης του φαρμάκου με τα βακτήρια.Ενδιαφέρον είναι επίσης το γεγονός ότι η ενισχυμένη αντιβακτηριδιακή δράση των λιποσωμάτων ΜΟΧ (σε σχέση με τη δράση του ελεύθερου φαρμάκου σε ίδια συγκέντρωση) εκδηλώνεται τόσο ως προς τα πλαγκτονικά όσο και προς τα βακτήρια που σχηματίζουν βιομεμβράνη, που είναι πιο δύσκολα αντιμετωπίσιμη με αντιβιοτικά φάρμακα.