Ταυτοποίηση νέων μη κωδικών RNAs (ncRNAs), μέσω αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS), και μελέτη της έκφρασής τους σε καρκινικά κύτταρα και στερεούς όγκους

Abstract

Colon cancer and prostate cancer constitute categories of solid malignancies. Chronic lymphocytic leukemia is also a major category of haematological malignancies. Colon cancer is the third most common cancer diagnosed in men and women, numbering hundreds of thousands of new cases worldwide, on an annual basis. This cancer is one of the leading (3rd in women and 2nd in men) causes of cancer death. At the same time, prostate cancer (PCa) is the perfect incidence of cancer in Europe and is the most common non-skin cancer among men. Hematologic malignancies are a heterogeneous group of diseases of the hematopoietic tissue and together, represent about 10% of all cancers. The discovery of new sensitive molecular biomarkers for the valid diagnosis, prognosis and prediction of treatment is also a major issue.Next-Generation Sequencing (NGS) is a state-of-the-art set of methodologies for large-scale genome and transcript studies, as it allows the sequencing of an extremely large number of nucleic acid molecules without the need to design an equally large number of nucleotides. . For these reasons, NGS is a "revolution" in the fields of Molecular Biology. One of the most important applications of NGS technology is RNA sequencing (RNA-seq), a method for detailed transcript analysis. The application of RNA-seq and modern bioinformatics tools has revealed the existence of an abundance of ncRNAs that are transcribed from the genome. NcRNAs are divided by size into two broad categories, the short-lived ncRNA (sncRNA) and the large ncRNA (lncRNA) molecules.Data from research related to the sequencing of the human genome suggest that more than 80% of human DNA is transcriptionally active. However, less than 3% encode proteins. Non-coding RNAs (ncRNAs) are distinguished into regulatory ncRNAs as well as housekeeping ncRNAs. The latter include ribosomal RNAs (rRNAs) and transport RNAs (tRNAs). Regulatory ncRNAs depending on their size can be divided into two groups: small ncRNAs (<200 nucleotides) and larger long non coding RNAs, lncRNAs (> 200 nucleotides). Small RNAs contain microRNAs, small nuclear RNAs (snRNAs), small nuclear RNAs (snoRNAs), small interfering RNAs (siRNAs) and RNAs that interact with the PIWI protein (piRNAs). It is worth noting that the largest percentage of human cellular RNA consists of ribosomal rRNA. Other abundant species, such as mRNA, snoRNA and snRNA, are expressed at levels 1-2 times lower than rRNA and tRNA. MicroRNAs may also show high levels of expression, but this depends on the type and function of each cell (eg microRNA-92a-3p). In cancer samples they are found to have a deviant expression from normal samples. Altering the expression of microRNAs in turn affects the expression of a few tens-hundreds of genes. The expression of microRNAs is also affected by the permethylation and hypomethylation of CpG islets, specifically in colorectal cancer. As for lncRNAs, overall they are relatively low. Finally, it is worth mentioning that more and more types of non-coding RNAs are being discovered, such as enhancer RNAs (eRNAs), which are thought to act by regulating the three-dimensional structure of chromosomes near the transcription sites. Another example is cyclic RNAs that act as sponge microRNAs, as they homologize with them and thus prevent them from interacting with other molecules.The present study aims at the molecular identification, study and evaluation of new biomolecules that can be used as molecular biomarkers, mainly in colon and prostate cancer. In the present dissertation, cutting-edge molecular methodologies - such as Next-Generation Sequencing (NGS) - have been applied to identify, develop assay protocols, and study the expression of new small non-coding RNA (sncRNA) molecules.With this approach, 10 novel small non-coding RNA molecules were identified and registered in the corresponding database (GeneBank of NCBI). This was followed by the development and validation of molecular methodologies for their determination in cancer cells and tissues, and then their expression in a number of cancer lines and in colon and prostate cancer tissues was studied. At the same time, the effect of chemotherapeutic drugs on colon cancer cell lines was studied while an in vitro study of cell viability and proliferation rate was performed, as well as a study of the cytotoxicity of chemotherapeutic drugs.The results showed that a) In the cells of the human colon cancer cell line Caco-2, incubated with the anti-cancer drug Irinotecan, there is a marked increase in the expression levels of MT815884 after 24 hours which decreases to 48 and 72 hours of incubation. Regarding the effect of Elotaxin, a gradual increase in incubation time-related effects was observed that was not observed with methotrexate. b) The expression of the non-coding RNA 28S rRF molecule (MT815881) in prostate cancer patients was found to be a new, candidate molecular biomarker with an unfavorable prognosis of the disease. c) Expression of the small non-coding miR-16-5p molecule was found to be a new, candidate molecular biomarker of adverse prognosis in colon adenocarcinoma. d) Expression of miR-92a-3p in peripheral blood mononuclear cells has been found to be a new, independent molecular biomarker with a favorable prognosis in chronic lymphocytic leukemia. In addition, a low-risk, high-risk patient molecular classification system was developed to address the risk of recurrence of the studied non-coding RNA molecules under study.

Ο καρκίνος του παχέος εντέρου και ο καρκίνος του προστάτη αποτελούν κύριες κατηγορίες στερεών κακοήθων όγκων, ενώ η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία αποτελεί έναν τύπο αιματολογικής κακοήθειας. Ο καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ο τρίτος κατά σειρά συνηθέστερος καρκίνος που διαγιγνώσκεται σε άνδρες και γυναίκες, αριθμώντας εκατοντάδες χιλιάδες νέα περιστατικά παγκοσμίως, σε ετήσια βάση. Ο καρκίνος αυτός αποτελεί μια από τις κυρίαρχες (3η στις γυναίκες και 2η στους άνδρες) αιτίες θανάτου από καρκίνο. Παράλληλα, ο καρκίνος του προστάτη (PCa) είναι ο τέταρτος σε συχνότητα εμφάνισης καρκίνος στην Ευρώπη και είναι ο πιο συχνός μη δερματικός καρκίνος μεταξύ των ανδρών. Οι αιματολογικές κακοήθειες είναι ετερογενής ομάδα νοσημάτων του αιμοποιητικού ιστού και συνολικά, αντιπροσωπεύουν περίπου το 10% του συνόλου των καρκίνων. Μεγάλο ζητούμενο αποτελεί η ανακάλυψη νέων ευαίσθητων μοριακών βιοδεικτών για την έγκαιρη διάγνωση, πρόγνωση και πρόβλεψη της θεραπευτικής αγωγής του καρκίνου. Στην αλληλούχηση επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing, NGS) συγκαταλέγονται σύγχρονες μεθοδολογίες για ευρείας κλίμακας μελέτες του γονιδιώματος και του μεταγραφώματος, που επιτρέπουν την παράλληλη αλληλούχηση ενός εξαιρετικά μεγάλου αριθμού μορίων νουκλεϊκών οξέων χωρίς να απαιτείται ο σχεδιασμός ενός εξίσου μεγάλου αριθμού εκκινητών. Για τους λόγους αυτούς, το NGS αποτελεί «επανάσταση» στα πεδία της Μοριακής Βιολογίας. Μια από τις σημαντικότερες εφαρμογές της τεχνολογίας NGS είναι η αλληλούχηση RNA (RNA-seq), μια μέθοδος για τη λεπτομερή ανάλυση του μεταγραφώματος. Η εφαρμογή του RNA-seq και τα σύγχρονα εργαλεία βιοπληροφορικής φανέρωσαν την ύπαρξη μιας πληθώρας μη κωδικών μορίων RNA (non coding RNAs, ncRNAs) που μεταγράφονται από το γονιδίωμα. Τα ncRNA χωρίζονται βάσει μεγέθους σε δυο ευρείς κατηγορίες, τα μικρού μήκους ncRNA (sncRNA) και τα μεγάλα ncRNA (lncRNA) μόρια.Τα δεδομένα που έχουν προκύψει μέσα από τις έρευνες οι οποίες σχετίζονται με τον προσδιορισμό της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος υποδηλώνουν ότι ποσοστό μεγαλύτερο από το 80% του ανθρώπινου DNA είναι μεταγραφικά ενεργό. Ωστόσο, λιγότερο από το 3% κωδικοποιεί πρωτεΐνες. Τα μη κωδικά μόρια RNA διακρίνονται σε ρυθμιστικά ncRNAs καθώς και σε "housekeeping" ncRNAs. Τα τελευταία περιλαμβάνουν τα ριβοσωμικά RNAs (rRNAs) και τα μεταφορικά RNAs (tRNAs). Τα ρυθμιστικά ncRNAs ανάλογα με το μέγεθος τους μπορούν να διαχωριστούν σε δύο ομάδες: τα μικρά ncRNAs (<200 νουκλεοτίδια) και τα μεγάλα (long non coding RNAs, lncRNAs, >200 νουκλεοτίδια). Τα μικρά μη κωδικά μόρια RNA (sncRNA) περιλαμβάνουν τα microRNAs (miRNAs), τα μικρά πυρηνικά RNAs (snRNAs), τα μικρά πυρηνισκικά RNAs (snoRNAs), τα μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs (siRNAs), τα RNAs που αλληλεπιδρούν με την πρωτεΐνη PIWI, (piRNAs) κ.ά. Αξίζει να σημειωθεί πως το μεγαλύτερο ποσοστό του ανθρώπινου κυτταρικού RNA αποτελείται από ριβωσιμικό rRNA. Άλλα είδη, όπως τα mRNA, snoRNA και snRNA εκφράζονται σε μικρότερα επίπεδα από τα rRNA και tRNA. Τα microRNAs μπορεί να εμφανίζουν και αυτά υψηλά επίπεδα έκφρασης, αλλά αυτό εξαρτάται από τον τύπο και την λειτουργία του κάθε κυττάρου (π.χ microRNA-92a-3p). Πολλές φορές στα καρκινικά δείγματα βρίσκονται να έχουν παρεκκλίνουσα έκφραση από τα φυσιολογικά δείγματα. Η αλλαγή της έκφρασης των microRNAs επηρεάζει με τη σειρά της την έκφραση μερικών δεκάδων–εκατοντάδων γονιδίων. Η έκφραση των microRNAs επηρεάζεται και αυτή από την υπερμεθυλίωση και την υπομεθυλίωση των CpG νησίδων. Όσον αφορά στα lncRNAs, συνολικά, παρουσιάζουν σχετικά χαμηλή έκφραση. Τέλος, αξίζει να αναφερθεί πως ανακαλύπτονται ολοένα και περισσότερα είδη μη κωδικών RNA, όπως τα enhancer RNAs (eRNAs), τα οποία θεωρείται πως δρουν ρυθμίζοντας την τρισδιάστατη δομή των χρωμοσωμάτων κοντά στις θέσεις της μεταγραφής. Ένα άλλο παράδειγμα είναι, επίσης, τα κυκλικά RNAs που λειτουργούν πολλές φορές σαν «σφουγγάρι» των microRNAs, καθώς εμφανίζουν ομολογία με αυτά και εμποδίζουν με αυτόν τον τρόπο την αλληλεπίδρασή τους με άλλα μόρια.Η παρούσα διδακτορική διατριβή αποσκοπεί στη μοριακή ταυτοποίηση, μελέτη και αξιολόγηση νέων βιομορίων τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως μοριακοί βιοδείκτες, κυρίως στον καρκίνο του παχέος εντέρου και του προστάτη αλλά και στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, εφαρμόσθηκαν μοριακές μεθοδολογίες αιχμής – όπως η αλληλούχηση επόμενης γενιάς (Next-Generation Sequencing, NGS) – για την ταυτοποίηση, ανάπτυξη πρωτοκόλλων προσδιορισμού και τη μελέτη έκφρασης νέων μικρών μη κωδικών μορίων RNA (sncRNA). Με τη συγκεκριμένη προσέγγιση, πραγματοποιήθηκε η ταυτοποίηση 10 νέων μικρών μη κωδικών μορίων RNA τα οποία και καταχωρήθηκαν στην αντίστοιχη τράπεζα δεδομένων (GeneBank® of NCBI). Ακολούθησε η ανάπτυξη και η επικύρωση μοριακών μεθοδολογιών προσδιορισμού τους σε καρκινικά κύτταρα και ιστούς ενώ στη συνέχεια μελετήθηκε η έκφρασή τους σε πλήθος καρκινικών σειρών αλλά και σε καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου και προστάτη. Παράλληλα, μελετήθηκε η δράση χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε καρκινικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου ενώ πραγματοποιήθηκε in vitro μελέτη της βιωσιμότητας και του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων, καθώς και μελέτη της κυτταροτοξικότητας των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι α)Στα κύτταρα της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής σειράς παχέος εντέρου Caco-2, που επωάστηκαν με το αντικαρκινικό φάρμακο Irinotecan παρατηρείται αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων έκφρασης του MT815884 μετά από 24 ώρες η οποία ελαττώνεται στις 48 και 72 ώρες επώαση. Όσον αφορά στην επίδραση του Elotaxin, παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση σχετιζόμενη με το χρόνο επώασης, φαινόμενα που δεν παρατηρήθηκαν με το φάρμακο μεθοτρεξάτη. β) Η έκφραση του μη κωδικού μορίου RNA 28S rRF (MT815881) σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη βρέθηκε να αποτελεί ένα νέο, υποψήφιο μοριακό βιοδείκτη δυσμενούς πρόγνωσης της νόσου. γ) Η έκφραση του μικρού μη κωδικού μορίου miR-16-5p βρέθηκε να αποτελεί ένα νέο, υποψήφιο μοριακό βιοδείκτη δυσμενούς πρόγνωσης στο αδενοκαρκίνωμα του παχέος εντέρου. δ) Η έκφραση του miR-92a-3p σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος βρέθηκε επίσης να αποτελεί ένα νέο, ανεξάρτητο μοριακό βιοδείκτη ευνοϊκής πρόγνωσης στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία.Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε η δημιουργία ενός προγνωστικού συστήματος μοριακής ταξινόμησης των ασθενών σε χαμηλού και υψηλού κινδύνου, αναφορικά με τον κίνδυνο εμφάνισης υποτροπής σχετικά με τα μελετώμενα μόρια μη κωδικών μορίων RNA.