Affirmation of dna barcoding as a powerful tool in cataloguing medicinal and aromatic plants in mediterranean forests

Abstract

From the pre-historic era, men have been using plants as medicine and in recent years, medicinal and aromatic plants (MAPs) harvested from the wild still remain of immense importance. MAPs are clearly an important global resource in terms of healthcare but they are also an important economic resource. Consequently, MAPs are an ideal case for developing DNA barcodes. In this doctorate thesis, more than 100 specimens were sampled in different biogeographic regions through Italy and Greece (three provenances from Italy and one from Greece) of each country including also some representatives from other countries for comparison. Thus, 38 medicinal and aromatic plant species have been collected and being analyzed, derived from 22 genera, with a total number of 30 different provenances belonging to 17 families. We used “core barcode” for land plants rbcL and matK, and tested trnH-psbA as additional marker. Each marker was amplified with the universal primer pairs.RbcL displayed 100% amplification success, followed by trnH-psbA 98%, while matK was unable to amplify some certain plant groups (overall amplification success of 91). Species discrimination success was attempted using sequence character states (Blastclust), presence of barcoding-gap (uncorrected p-distances), species monophyly through inference of RAxML dendrogram and assessment discrimination using GenBank. These approaches return similar results in the discrimination level of species using all combined markers. The trnH-psbA region showed the highest values of genetic variability; however this divergence did not allow reliable alignment across all sequences and consequently contributed to the absence of barcoding gap. Regarding the results retrieved from Genbank submissions, the lowest percentage of molecular data was retrieved surprisingly by MatK (37% of the species in GenBank), even if it is considered one of the most recommended core-barcodes with the highest discriminatory power. The majority of data were produced by trnH-psbA (65% of the species in GenBank) showed a good coverage, highlighting that this marker, beyond the core barcode, is becoming the most widely used plastid region. On the whole, conserving medicinal and aromatic plants biodiversity should be given a serious attention as well as the development of an integrated DNA database. An important limitation DNA barcoding potential users may actually meet is related with a yet incomplete reference list in the database as well as the common used similarity methods in these databases are prone to errors. Moreover, the use of a fourth marker could be necessary to obtain adequate discriminatory power. In conclusion, this doctorate thesis highlights the utility of DNA barcoding as a promising tool in providing a practical and standardized identification of medicinal and aromatic plants thus contributing to the conservation and the trade control of these valuable plant resources.

Από την προϊστορική εποχή, ο άνθρωπος χρησιμοποιεί τα φυτά ως φάρμακα ενώ τα τελευταία χρόνια τα φαρμακευτικά και αρωματικά φυτά (MAPs) που συλλέγονται φυσικά από το περιβάλλον διακατέχουν πρωταγωνιστικό ρόλο. Τα ΦΑΦ (MAPs - medicinal and aromatic plants) Φαρμακευτικά και Αρωματικά Φυτά κατέχουν πρωταγωνιστικό ρόλο στη σύγχρονη θεραπευτική αποτελώντας παράλληλα έναν σημαντικό οικονομικό πόρο. Κατά συνέπεια, τα ΦΑΦ αποτελούν ιδανική περίπτωση για την ανάπτυξη της γενετικής μεθόδου κωδικοποίησης DNA. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, περισσότερα από 100 δείγματα συλλέχθηκαν από διαφορετικές βιογεωγραφικές περιοχές της Ιταλίας και της Ελλάδας (για κάθε είδος, τρεις προελεύσεις δειγμάτων από την Ιταλία και μία από την Ελλάδα) συμπεριλαμβανομένων επίσης ορισμένων εκπροσώπων ειδών από άλλες χώρες για γενετική σύγκριση. Ως εκ τούτου, συλλεχθηκαν και αναλύθηκαν 38 φαρμακευτικά και αρωματικά φυτικά είδη, που προέρχονται από 22 γένη, με συνολικό αριθμό 30 διαφορετικών προελεύσεων που ανήκουν σε 17 οικογένειες φυτών. Χρησιμοποιήθηκε "πυρήνας barcode" για τα φυτά της ξηράς rbcL και matK, ενώ δοκιμάστηκε ο trnH-psbA ως πρόσθετος δείκτης.Ο RbcL παρουσίασε 100% επιτυχία πολλαπλασιασμού, ακολουθούμενος από τον trnH-psbA 98%, ενώ ο matK δεν ήταν σε θέση να πολλαπλασιάσει ορισμένες συγκεκριμένες ομάδες φυτών (συνολική επιτυχία ενίσχυσης 91). Η επιτυχία διάκρισης των ειδών επιχειρήθηκε με τη χρήση διαδοχικών αλληλουχιών με τη χρήση Blastclust, την παρουσία του barcoding-gap (μη διορθωμένες p-αποστάσεις), εξετάστηκε η μονοφιλία των ειδών μέσω της απεικόνισης του δενδρογράμματος RAxML ελέγχοντας τις γενετικές αποστάσεις των ειδών ενώ τέλος λήφθηκε υπόψη η διάκριση των ειδών μέσω της αξιολόγησης του GenBank. Οι παραπάνω προσεγγίσεις αποδίδουν παρόμοια αποτελέσματα σε επίπεδο διακρίσεων των ειδών χρησιμοποιώντας όλους τους συνδυασμένους δείκτες. Η περιοχή trnH-psbA συγκέντρωσε τις υψηλότερες τιμές γενετικής μεταβλητότητας. Ωστόσο, αυτή η απόκλιση δεν επέτρεψε αξιόπιστη ευθυγράμμιση όλων των αλληλουχιών και, κατά συνέπεια, συνέβαλε στην απουσία του barcoding gap. Όσον αφορά τα αποτελέσματα που ανακτήθηκαν από τις καταχωρήσεις των αλληλουχιών στην πλατφόρμα Genbank, το χαμηλότερο ποσοστό μοριακών δεδομένων ανακτήθηκε από την MatK (το 37% των ειδών στη GenBank), ακόμη και αν θεωρείται ένας από τους πιο διαδεδομένους και προτεινόμενους βασικούς κώδικες με τη μεγαλύτερη διακριτική ισχύ. Η πλειονότητα των δεδομένων που καταχωρήθηκαν για την περιοχή trnH-psbA (65% των ειδών στη GenBank) αποδείχθηκε ικανοποιητική με αρκετά καλή κάλυψη, τονίζοντας ότι αυτός ο δείκτης, συνίσταται ως η πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη πλαστιδική περιοχή. Γενικά, πρέπει να δοθεί ιδιαίτερη προσοχή στη διατήρηση της βιοποικιλότητας των φαρμακευτικών και αρωματικών φυτών, μέσω της ανάπτυξης μίας πλήρους, ολοκληρωμένης βάσης δεδομένων DNA. Ένας σημαντικός περιορισμός για την ανάπτυξη της μεθόδου του DNA barcoding σε πιθανούς δυνητικούς χρήστες συσχετίζεται άμεσα με την ελλιπή λίστα αναφοράς της βάσης δεδομένων, καθώς και η άμεση ανάπτυξη περισσότερο εξελιγμένων μεθόδων ομοιότητας με μικρότερη πιθανότητα σφαλμάτων. Επιπλέον, η χρήση τέταρτου δείκτη θα μπορούσε να είναι αναγκαία για την απόκτηση επαρκούς κάλυψης αναγνώρισης και διαχωρισμού των ειδών. Εν κατακλείδι, η παρούσα διδακτορική διατριβή υπογραμμίζει τη χρησιμότητα του DNA barcode ως ένα ελπιδοφόρο εργαλείο για την παροχή πρακτικής και τυποποιημένης αναγνώρισης των φαρμακευτικών και αρωματικών φυτών συμβάλλοντας έτσι στη διατήρηση και τον έλεγχο του εμπορίου αυτών των πολύτιμων φυτικών πόρων.

Sin dalla preistoria l’uomo usa le piante a scopo medicamentoso. Negli ultimi anni le piante medicinali aromatiche (PAM), raccolte in ambienti selvatici, hanno avuto un’ importanza immensa. Le PAM sono delle risorse molto importante sia a livello globale e sia per la salute, ed hanno un ruolo economico importante. Di conseguenza i PAM sono l’ideale per sviluppare il DNA barcoding. Per questa tesi sono stati analizzati più di 100 campioni da varie zone biogeografiche, proveniente da tre provincie italiane ed una greca includendo anche campioni da altri paesi per un miglior paragone. Sono 38, le specie di piante aromatiche e medicinali raccolte ed analizzate, da 22 generi, con un numero totale di 30 provenienze diverse appartenenti a 17 famiglie. Abbiamo utilizzato “core barcode” con i markatori rbcL e matK per le piante e trnH-psbA come markatore addizionale. Ogni markatore è stato amplificato con le coppie di marker universale. RbcL ha avuto il 100% di riuscita seguito dal trnH-psbA con il 98% di riuscita e dal MatK che ha avuto una riuscita bassa per alcune specie di piante ( 91% riuscita di amplificazione). La discriminazione fra le specie è stata ottenuta usando: le sequenze dello stato del carattere (Blastclust), le presenze del barcoding-gap (distanze p non agiustate), la monophylia delle specie usando l’interferenza della dendrograma RaxML e la valutazione della discriminazione usando GenBank. Tutti questi approcci determinano risultati similari al livello della discriminazione delle specie usando tutti i markatori combinati. La regione trnH-psbA ha mostrato i piu elevati valori della variabilità genetica, comunque questa divergenza non ha permesso un allignamento affidabile per tutte le sequenze e di conseguenza ha contribuito alla assenza del barcoding gap. I risultati di Genbank mostrano che la percentuale più bassa di dati molecolari e stata ricevuta sorprendentemente da MatK (37% dalle specie GenBank), nonostante il marker è il più raccomandato per core-barcode con il più alto potere discriminativo. La magior parte dei dati sono stati prodotti da trnH-psbA (65% delle specie di Genbank) mostrando una buona copertura, evidenziando che questo marker oltre core barcode comincia ad essere il più usato per le zone dei plastidi. Quindi, la conservazione della biodiversità delle specie di piante aromatiche e medicinali merita un’elevata attenzione ed anche uno sviluppo sulla base dei dati che ci fornisce il DNA. Una limitazione importante nel DNA barcoding è dovuta alla lista incompleta nel database, ed anche grazie agli errori trovati nei metodi di similitudine comunamente usati. Inoltre sarebbe necessario l’uso del quattro marker per ottenere un potere discriminatorio adeguato. In conclusione, questa tesi sottolinea l’utilità del DNA barcoding che è uno strumento utile per fornire una buona identificazione pratica e standardizzata delle piante aromatiche e medicinale; contribuendo alla conservazione ed al controllo del commercio di queste risorse preziose.