Μελέτη της λιποφαγικής δραστηριότητας στον καρκίνο του προστάτη και ο ρόλος της στην ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων στην ακτινοθεραπεία και χημειοθεραπεία

Abstract

Prostate cancer (PCa) is the second most common malignancy diagnosed among men in the western world and the fifth leading cause of cancer-related deaths in males. Thus, there is a scientific need for a multifactorial study of PCa biology, tumor growth, metastasis and response to treatment modalities. Such investigation may result in the discovery of new potential targets used to improve the efficacy of anticancer therapies. The main objective of the present study was to investigate how lipophagy was involved in PCa development, and to determine if interference with this cellular mechanism would affect response of PCa cancer cells to radiotherapy and chemotherapy. Radiotherapy is a principal treatment modality for localized and locally advanced PCa, and chemotherapy, mainly based on docetaxel delivery, is a treatment of choice for addressing advanced metastatic castration resistant PCa. However, metabolic reprogramming, including changes in lipid metabolism, is considered to be one of the adaptive events of cancer cells that drive tumor progression and may reduce treatment efficacy, resulting in tumor relapse and poor therapeutic outcome. In the current study, we investigated the role of a key lipophagy-related protein, known as perilipin-3 (PLIN3), in PCa response to radiotherapy and chemotherapy. PLIN3 is a structural protein associated with lipophagy and lipid droplet (LDs) integrity, and overexpression of this protein is associated with tumor aggressiveness. Moreover, we investigated the involvement of a lysosomal-related protein tightly connected with lipophagy, known as lysosomal acid lipase (LAL), in PCa response after radiotherapy. In detail, three parental PCa cell lines, two hormone-refractory (DU145, PC3) and one hormone-responsive (22Rv1), were used to develop each stably transfected cell lines used in this study. These newly stably transfected fluorescent cell lines were developed utilizing a 2nd generation lentiviral system, in order to have a control phenotype without silencing any gene (shControl), and either a PLIN3-depleted (shPLIN3) or a LAL-depleted (shLAL) phenotype. Subsequently, regarding DU145, 22Rv1 and PC3 cell lines, we explored the in vitro and in vivo response to ionizing radiation of either PLIN3-depleted or LAL-depleted cell lines, compared with their shControl counterparts. For the in vivo studies, we used two GEMM (Genetically Engineered Mouse Models) strains, the NOD.SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J) and the R2G2 (B6.129-Rag2tm1FwaII2rgtm1Rsky/DwlHsd), in order to study the effects of PLIN3 silencing in response of PCa cell lines to radiotherapy. For all the studied PCa cell lines exposed in radiation, upon PLIN3 depletion, in vitro and in vivo experiments showed reduced proliferation and strong radiosensitization. Moreover, in vivo experiments demonstrated the significantly augmented radiotherapy efficacy upon PLIN3 depletion, resulting in impaired tumor development and extensive tissue necrosis.Furthermore, we evaluated the clinical role of PLIN3 and LAL protein expression patterns in series of PCa tissue specimens from patients treated with radical radiotherapy. PLIN3 overexpression in tissue specimens was correlated with increased MIB1 proliferation index, increased autophagy flux, reduced response to radiotherapy and poor prognosis. Moreover, assessment of PLIN3 expression patterns through immunohistochemistry may identify subgroups of PCa patients less responsive to radiotherapy, and at high risk of relapse post irradiation. Whether radiotherapy efficacy may be enhanced by concurrent autophagy, and direct or indirect PLIN3 inhibition in this sub-group of patients, demands further clinical evaluation. The impact of LAL depletion in PCa radiotherapy still remained elusive; hence further research is needed before any conclusion can be made regarding LAL protein. In relation to chemotherapy, we sought to explore the role of PLIN3 suppression in docetaxel cytotoxic activity in shControl and shPLIN3 PCa cell lines. Therefore, we studied the effects of PLIN3 depletion on autophagy-related proteins and gene expression patterns, apoptotic potential and proliferation rate of cancer cells.In respect to all studied PCa cell lines exposed in docetaxel, depletion of PLIN3 resulted in docetaxel resistance, due to their enhanced autophagic flux and reduced potential to initiate apoptosis. We further assessed the effect of autophagy suppression with chloroquine on docetaxel cytotoxicity. Inhibition of autophagy with chloroquine reversed the previously observed chemoresistance of stably transfected shPLIN3 PCa cell lines, with no adding effect on the shControl cells. It is worth mentioning that upon docetaxel treatment, all the shPLIN3 cell lines also exhibited reduced potential to initiate apoptosis and increased survivability compared to their shControl counterparts. In order to explain the observed chemoresistance of PCa upon PLIN3 depletion, we assessed PLIN3 expression patterns in a series of PCa tissue specimens from patients treated with radical prostatectomy, were complete or partial loss of PLIN3 expression was frequently noted in 70% of the evaluated specimens. Therefore, given the frequent loss of PLIN3 expression in PCa specimens, we suggested that combination of docetaxel with chloroquine may improve the efficacy of docetaxel treatment in PLIN3-deficient PCa patients. In conclusion, this study was a thorough investigation of the role of lipophagy/autophagy and metabolic turnover in PCa, post treatment with radiotherapy or chemotherapy. Overall, we demonstrated that upon PLIN3 depletion, PCa cells were found to be sensitive to radiotherapy both with in vitro and in vivo experiments. Moreover, we showed that depletion of PLIN3 protein triggered chemoresistance to docetaxel in PCa cells, mainly through enhancement of their autophagic flux. The observed chemoresistance in shPLIN3 PCa cells was reversed upon concurrent treatment with docetaxel and chloroquine. Finally, we propose that PLIN3 status, as indicated by immunohistochemistry evaluation, could be utilized as a potent diagnostic or prognostic biomarker in PCa treatment, offering a more personalized therapeutic strategy and improved overall survival rates.

O καρκίνος του προστάτη (PCa) αποτελεί τη δεύτερη συχνότερη κακοήθεια, που διαγιγνώσκεται στους άνδρες στον δυτικό κόσμο και την πέμπτη συχνότερη αιτία θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο. Ως εκ τούτου, υπάρχει έντονη επιστημονική ζήτηση για πολυπαραγοντικές μελέτες που σχετίζονται με την έρευνα της βιολογίας του PCa, την ανάπτυξη του όγκου, την μετάσταση και την ανταπόκρισή του PCa σε διάφορες θεραπευτικές προσεγγίσεις. Μια τέτοια έρευνα μπορεί να οδηγήσει στην ανακάλυψη νέων πιθανών μορίων-στόχων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτίωση ή την πρόβλεψη της αποτελεσματικότητας των αντικαρκινικών θεραπειών. Ο κύριος στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τον τρόπο με τον οποίο η λιποφαγία εμπλέκεται στην ανάπτυξη του PCa, καθώς και να προσδιοριστεί εάν η παρέμβαση σε αυτόν τον κυτταρικό μηχανισμό θα επηρεάσει την απόκριση των κυττάρων PCa στην ακτινοθεραπεία και στη χημειοθεραπεία. Η ακτινοθεραπεία είναι μια από τις κύριες μεθόδους θεραπείας για την αντιμετώπιση της τοπικά εντοπισμένης και της τοπικά προχωρημένης νόσου. Η χημειοθεραπεία, μέσω χορήγησης δοσεταξέλης, αποτελεί τη θεραπεία εκλογής για την αντιμετώπιση του προχωρημένου μεταστατικού PCa ανθεκτικού στον ευνουχισμό. Ωστόσο, ο επαναπρογραμματισμός του μεταβολισμού των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και των αλλαγών στο μεταβολισμό των λιπιδίων, θεωρείται ότι είναι ένα από τα πολλά προσαρμοστικά συμβάντα που καθοδηγούν την εξέλιξη ενός όγκου και μπορεί να μειώσει σταδιακά την αποτελεσματικότητα της θεραπείας, με συνέπεια την υποτροπή του όγκου και τη χαμηλή θεραπευτική έκβαση. Στην μελέτη αυτή διερευνήσαμε τον ρόλο της περιλιπίνης-3 (PLIN3) στην απόκριση του PCa κατά την ακτινοθεραπεία και τη χημειοθεραπεία. Η PLIN3 αποτελεί μια δομική πρωτεΐνη που σχετίζεται με τη λιποφαγία και την ακεραιότητα των λιπιδικών σταγόνων (LDs), ενώ η υπερέκφραση αυτής της πρωτεΐνης σχετίζεται με την επιθετικότητα του όγκου. Επιπλέον, διερευνήσαμε τη συμμετοχή της λυσοσωμικής όξινης λιπάσης (LAL), μιας πρωτεΐνης των λυσοσωμάτων που συνδέεται στενά με τη λιποφαγία, στην απόκριση του PCa μετά την ακτινοθεραπεία.Αναλυτικά, τρεις κυτταρικές σειρές PCa, δύο ορμονο-ανεξάρτητες (DU145, PC3) και μία ορμονο-εξαρτώμενη (22Rv1), χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη των 9 σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικών σειρών που διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Αυτές οι σταθερά διαμολυσθείσες φθορίζουσες κυτταρικές σειρές δημιουργήθηκαν με τη χρήση ενός συστήματος λεντοϊού 2ης γενιάς, προκειμένου να κατασκευαστούν τα κύτταρα PCa έτσι ώστε να φέρουν έναν φαινότυπο ελέγχου που δεν περιλαμβάνει αποσιώπηση κάποιου γονιδίου (shControl), καθώς και από δύο φαινότυπους με καταστολή της PLIN3 (shPLIN3) ή καταστολή της LAL (shLAL).Στη συνέχεια, όσον αφορά τις κυτταρικές σειρές DU145, 22Rv1 και PC3, διερευνήσαμε την in vitro απόκριση στην ιοντίζουσα ακτινοβολία, είτε των shPLIN3 είτε των shLAL κυττάρων, σε σύγκριση με τα αντίστοιχα shControl κύτταρα. Για τις in vivo μελέτες, χρησιμοποιήσαμε δύο είδη πειραματόζωων GEMM (Genetically Engineered Mouse Model), το NOD.SCID (NOD.CB17-Prkdcscid/J) και το R2G2 (B6.129-Rag2tm1FwaII2rgtm1Rsky/DwlHsd), προκειμένου να μελετήσουμε την απόκριση των shControl και των shPLIN3 κυτταρικών σειρών PCa στην ακτινοθεραπεία. Για όλες τις μελετημένες κυτταρικές σειρές PCa που εκτέθηκαν σε ακτινοβολία, κατά την καταστολή της PLIN3 πρωτεΐνης, τα πειράματα in vitro και in vivo έδειξαν μειωμένο ρυθμό κυτταρικής διαίρεσης και αξιοσημείωτη ακτινο-ευαισθητοποίηση. Επιπλέον, τα in vivo πειράματα έδειξαν τη σημαντικά αυξημένη αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας στα shPLIN3 κύτταρα, με αποτέλεσμα την μειωμένη ικανότητα ανάπτυξης του όγκου και την εκτεταμένη νέκρωση των ιστών. Επιπλέον, αξιολογήθηκε η κλινική συνάφεια των παρατηρούμενων αλλαγών των επιπέδων έκφρασης για τις πρωτεΐνες PLIN3 και LAL σε ένα σύνολο δειγμάτων ιστού PCa από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε ριζική ακτινοθεραπεία. Συγκεκριμένα, η υπερέκφραση της PLIN3 πρωτεΐνης σε δείγματα ιστού PCa συσχετίστηκε με αυξημένο δείκτη πολλαπλασιασμού MIB1, αυξημένη αυτοφαγική ροή, μειωμένη απόκριση στην ακτινοθεραπεία και συνολικά κακή πρόγνωση. Συνεπώς, η αξιολόγηση των προτύπων έκφρασης της PLIN3 πρωτεΐνης μέσω της ανοσοϊστοχημείας μπορεί να εντοπίσει υποομάδες ασθενών με PCa, οι οποίοι ενδέχεται να ανταποκρίνονται λιγότερο στην ακτινοθεραπεία και να βρίσκονται σε υψηλό κίνδυνο υποτροπής μετά την ακτινοβόληση. Επομένως, απαιτείται περαιτέρω κλινική αξιολόγηση, ώστε να εκτιμήσουμε εάν η αποτελεσματικότητα της ακτινοθεραπείας μπορεί να ενισχυθεί με ταυτόχρονη διακοπή της αυτοφαγίας, καθώς και με άμεση ή έμμεση καταστολή της PLIN3 σε αυτήν την υποομάδα ασθενών. Όσον αφορά την καταστολή της LAL πρωτεΐνης, ο αντίκτυπος της στην ακτινοθεραπεία του PCa παρέμεινε ακόμη ασαφής. Ως εκ τούτου, απαιτείται περαιτέρω έρευνα πριν μπορέσει να διεξαχθεί οποιοδήποτε ασφαλές συμπέρασμα σχετικά με την επίδραση της LAL πρωτεΐνης. Σχετικά με την απόκριση του PCa στη χημειοθεραπεία, επιδιώξαμε να διερευνήσουμε το ρόλο της καταστολής της PLIN3 στην κυτταροτοξική δράση της δοσεταξέλης στα shControl και shPLIN3 κύτταρα PCa. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι επιδράσεις από την καταστολή της PLIN3 πρωτεΐνης στην αυτοφαγία, στο αποπτωτικό δυναμικό και στον ρυθμό πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων. Όσον αφορά τις κυτταρικές σειρές PCa που εκτέθηκαν στη δοσεταξέλη, τα shPLIN3 κύτταρα εμφάνισαν ανθεκτικότητα σε αυτήν, εξαιτίας της ενισχυμένης αυτοφαγικής ροής και μειωμένης ικανότητας έναρξης της απόπτωσης που εκδήλωσαν. Συνεπώς, αξιολογήσαμε την επίδραση της καταστολής της αυτοφαγίας μέσω χλωροκίνης, στην κυτταροτοξικότητα της δοσεταξέλης. Η διακοπή της αυτοφαγίας μετά από χορήγηση χλωροκίνης ανέστρεψε την παρατηρηθείσα χημειο-ανθεκτικότητα των shPLIN3 κυττάρων PCa, χωρίς όμως να προκαλέσει ανάλογο αποτέλεσμα στα shControl κύτταρα. Επίσης, όλες οι shPLIN3 κυτταρικές σειρές εμφάνισαν μειωμένη ικανότητα έναρξης της απόπτωσης και αυξημένη ικανότητα επιβίωσης σε σύγκριση με τα shControl κύτταρα μετά την έκθεσή τους στη δοσεταξέλη. Προκειμένου να εξηγηθεί η παρατηρούμενη χημειοανθεκτικότητα του PCa κατά την καταστολή της PLIN3, αξιολογήσαμε τα πρότυπα έκφρασης της σε δείγματα ιστών PCa από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ριζική προστατεκτομή, όπου παρατηρήθηκε η μερική ή πλήρης απώλεια έκφρασης της PLIN3 στο 70% του συνόλου των αξιολογηθέντων δειγμάτων. Επομένως, δεδομένης της συχνής απώλειας της PLIN3 πρωτεΐνης σε δείγματα PCa, προτείναμε ότι ο συνδυασμός δοσεταξέλης με χλωροκίνη μπορεί να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας σε ασθενείς των οποίων η βιοψία υποδήλωσε καρκινικά κύτταρα με απουσία έκφρασης της PLIN3. Συμπερασματικά, αυτή η μελέτη αποτέλεσε μια διεξοδική διερεύνηση του ρόλου της λιποφαγίας/αυτοφαγίας και του μεταβολισμού του PCa μετά τη χορήγηση ακτινοθεραπείας ή χημειοθεραπείας. Συνολικά δείξαμε ότι κατά την χορήγηση ακτινοβολίας, τα shPLIN3 κύτταρα PCa εμφανίστηκαν ευαίσθητα στην ακτινοθεραπεία τόσο με in vitro όσο και με in vivo πειράματα. Επίσης, δείξαμε ότι η καταστολή της PLIN3 πρωτεΐνης πυροδότησε τη χημειο-ανθεκτικότητα των κυττάρων PCa, κυρίως μέσω της ενίσχυσης της αυτοφαγικής ροής τους. Η παρατηρούμενη χημειο-ανθεκτικότητα στα shPLIN3 κύτταρα PCa αντιστράφηκε με ταυτόχρονη χορήγηση δοσεταξέλης και χλωροκίνης. Τέλος, προτείνουμε ότι τα επίπεδα έκφρασης της PLIN3 στον PCa, όπως υποδεικνύονται από την ανοσοϊστοχημική εκτίμηση της βιοψίας του κάθε ασθενή, θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ισχυρός διαγνωστικός ή προγνωστικός βιοδείκτης στη θεραπεία του PCa, προσφέροντας έτσι μια πιο εξατομικευμένη θεραπευτική στρατηγική και βελτιωμένα ποσοστά επιβίωσης.