Διερεύνηση του ρόλου της πρωτεϊνης α-συνουκλεΐνης στην παθογένεια της ατροφίας πολλαπλών συστημάτων

Abstract

Multiple System Atrophy is a rare debilitating disease characterized by the presence of distinct glial cytoplasmic inclusions within oligodendrocytes. These inclusions are mainly composed of the neuronal protein alpha-synuclein and the oligodendroglia-specific phosphoprotein TPPP/p25α. The precise role of oligodendroglial alpha-synuclein and p25α in the formation of glial cytoplasmic inclusions and the subsequent neuronal death, as well as the proteolytic mechanisms involved in their turnover in health and disease remains hitherto unclear. To address these questions, we have utilized three immortalized oligodendroglial cell lines originated from rat brain glial cultures: wild-type oligodendrocytes (OLN-93) expressing low to non-detectable levels of the endogenous alpha-synuclein and p25α and cells stably overexpressing human alpha-synuclein (OLN-AS7) or human p25α (OLN-p25α). In parallel, we have used primary cultures of differentiated oligodendroglial cells deriving from wild-type (WT-aSyn) mice or transgenic mice lacking the endogenous alpha-synuclein expression (KO-aSyn) or overexpressing human alphasynuclein selectively in oligodendrocytes (PLP-haSyn). Both cell lines and primary oligodendrocytes were incubated with human alpha synuclein pre-formed fibrils as a model of alpha-synucleinopathy. Initially, we verified that alpha-synuclein fibrils are readily taken up by oligodendroglial cells and can recruit minute amounts of endogenous alpha-synuclein into the formation of insoluble, highly aggregated, pathological assemblies. The overexpression of human alpha-synuclein or p25α accelerates the recruitment of the endogenous protein and the generation of such aberrant species. In fibril-treated primary oligodendrocytes, the microtubule and myelin networks are disrupted, thus recapitulating a pathological hallmark of Multiple System Atrophy, in a manner totally dependent upon the presence of endogenous alpha-synuclein.Furthermore, utilizing oligodendroglial and cortical cultures, we demonstrated that the pathology-related phosphorylation of alpha-synuclein at Serine 129 depends on alpha-synuclein and p25α protein load and may involve different alpha-synuclein “strains” present in oligodendroglial and neuronal synucleinopathies. Importantly, this hypothesis was further supported by data obtained from human post-mortem brain material derived from patients with Multiple System Atrophy and dementia with Lewy bodies, where alpha-synuclein accumulates in neurons. Importantly, delivery of alpha-synuclein fibrils into the mouse striatum led to the formation of aberrant alpha-synuclein forms within oligodendroglia, incorporating the endogenous protein, and evoked myelin decompaction in WT-aSyn mice, but not in KO-aSyn mice.In order to elucidate the degradation mechanisms responsible for the removal of both endogenous oligodendroglial alpha-synuclein and p25α, we pharmacologically and molecularly modulated the autophagy-lysosome pathway and performed pharmacological inhibition of the proteasome. According to our results, both the endogenous oligodendroglial alpha-synuclein and p25α are degraded mainly by the autophagy-lysosome pathway in oligodendroglial cell lines and murine primary oligodendrocytes under basal conditions. We have also identified a KFERQ-like motif in p25α sequence that enables its effective degradation via chaperone-mediated autophagy in an in vitro system of isolated rat brain lysosomes. Utilizing pre-formed alpha-synuclein fibrils as seeds of pathology, we thoroughly characterized the contribution of autophagy-lysosome pathway in the removal of the exogenously added and the seeded oligodendroglial alpha-synuclein pathological assemblies. We have also showed that inoculation with alpha-synuclein fibrils impairs autophagic flux in oligodendrocytes and that p25α exerts an inhibitory effect on macroautophagy, while at the same time chaperone-mediated autophagy is upregulated, probably as a compensatory mechanism, to remove the pathological alpha-synuclein species formed within oligodendrocytes.Collectively, this line of research highlights the role of endogenous alpha-synuclein and p25α in the formation of pathological aSyn assemblies in experimental models of Multiple System Atrophy. In addition, this study pinpoints the contribution of chaperone-mediated autophagy andmacroautophagy in the regulation of oligodendroglial alpha-synuclein and p25α levels, in physiological and pathological conditions and highlights their targeting as a potential therapeutic strategy against Multiple System Atrophy.

Η Ατροφία Πολλαπλών Συστημάτων αποτελεί μια σπάνια προοδευτική νευροεκφυλιστική νόσο η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία Γλοιακών Κυτταροπλασματικών Εγκλείστων στα ολιγοδενδροκύτταρα. Τα έγκλειστα αυτά αποτελούνται κυρίως από τη νευρωνική πρωτεΐνη α-συνουκλεΐνη και την ολιγοδενδρογλοιακή φωσφοπρωτεΐνη ΤΡΡΡ/p25α. O ακριβής ρόλος των ολιγοδενδρογλοιακών πρωτεϊνών α-συνουκλεΐνη και p25α στο σχηματισμό των Γλοιακών Κυτταροπλασματικών Εγλείστων και τον επακόλουθο νευρωνικό θάνατο, καθώς και οι πρωτεολυτικοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην απομάκρυνση αυτών των πρωτεϊνών υπό φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες, παραμένουν εν πολλοίς άγνωστοι.Προκειμένου να απαντήσουμε σε αυτά τα ερωτήματα, χρησιμοποιήσαμε τρεις αθανατοποιημένες κυτταρικές σειρές ολιγοδενδροκυττάρων προερχόμενες από εγκέφαλο επίμυος: κύτταρα αγρίου τύπου (OLN-93) με ελάχιστα έως μη-ανιχνεύσιμα επίπεδα ενδογενούς α-συνουκλεΐνης και p25α και ολιγοδενδροκύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά την ανθρώπινη α-συνουκλεΐνη (OLN-AS7) ή την p25α (OLN-p25α). Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν πρωτογενείςκαλλιέργειες διαφοροποιημένων ολιγοδενδροκυττάρων προερχόμενων από αγρίου τύπου (WTaSyn) μύες και διαγονιδιακούς μύες που στερούνται πλήρως την έκφραση ενδογενούς α-συνουκλεΐνης (KO-aSyn) ή υπερεκφράζουν την ανθρώπινη α-συνουκλεΐνη επιλεκτικά στα ολιγοδενδροκύτταρα (PLP-haSyn). Κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς καλλιέργειες επωάστηκαν με προ-σχηματισμένα ινίδια α-συνουκλεΐνης ανθρώπινης προέλευσης ως μοντέλο α-συνουκλεϊνοπάθειας. Αρχικά, διαπιστώθηκε ότι τα ινίδια α-συνουκλεΐνης προσλαμβάνονται γρήγορα από τα ολιγοδενδρογλοιακά κύτταρα και μπορούν να στρατολογήσουν την ενδογενή πρωτεΐνη στο σχηματισμό αδιάλυτων, παθολογικών συσσωματωμάτων. Η υπερέκφραση των πρωτεϊνών α-συνουκλεΐνη ή/και p25α επιταχύνει τη στρατολόγηση της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης και τη δημιουργία παθολογικών διαμορφώσεων αυτής. Στις πρωτογενείς καλλιέργειες ολιγοδενδροκυττάρων οι οποίες επωάστηκαν με ινίδια α-συνουκλεΐνης,παρατηρήθηκε και αποδιοργάνωση του δικτύου των μικροσωληνίσκων και της μυελίνης, προσομοιώνοντας έτσι ένα παθολογικό χαρακτηριστικό της νόσου, το οποίο φαίνεται να εξαρτάται πλήρως από την παρουσία της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης.Επιπρόσθετα, χρησιμοποιώντας απομονωμένες πρωτογενείς καλλιέργειες ολιγοδενδροκυττάρων και νευρώνων, δείξαμε ότι η σχετιζόμενη με την παθολογία φωσφορυλίωση της α-συνουκλεΐνης στο αμινοξικό κατάλοιπο σερίνης 129 εξαρτάται από το πρωτεϊνικό φορτίο α-συνουκλεΐνης και p25α και μπορεί να περιλαμβάνει διαφορετικά «στελέχη» της πρωτεΐνης παρόντα σε ολιγοδενδρογλοιακές και νευρωνικές συνουκλεϊνοπάθειες. Αυτή η υπόθεση υποστηρίχθηκε περαιτέρω από δεδομένα που ελήφθησαν από ανθρώπινο μεταθανάτιο εγκεφαλικό υλικό ασθενών με Ατροφία Πολλαπλών Συστημάτων ή με άνοια με σώματα Lewy, στην οποία τα συσσωματώματα α-συνουκλεΐνης εντοπίζονται σε νευρώνες. Η σημασία της ενδογενούς α-συνουκλεΐνης στην εκδήλωση παθολογίας επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε in vivo πειράματα, όπου η έγχυση ινιδίων α-συνουκλεΐνης στον εγκέφαλο μυών οδήγησε στο σχηματισμό παθολογικών διαμορφώσεων α-συνουκλεΐνης εντός των ολιγοδενδροκυττάρων, οι οποίες συμπεριελάμβαναν την ενδογενή πρωτεΐνη και προκάλεσαν την αποδιοργάνωση του δικτύου μυελίνης σε μύες αγρίου τύπου, αλλά όχι σε μύες οι οποίοι στερούνταν την έκφραση α-συνουκλεΐνης.Προκειμένου να εξακριβώσουμε τους μηχανισμούς αποικοδόμησης τόσο της ολιγοδενδρογλοιακής α-συνουκλεΐνης όσο και της p25α, πραγματοποιήσαμε αναστολή της οδού αυτοφαγίας-λυσοσώματος με φαρμακολογικά και μοριακά μέσα, καθώς και φαρμακολογική αναστολή του πρωτεασώματος. Τα αποτελέσματά μας υποδεικνύουν ότι οι ενδογενείς ολιγοδενδρογλοιακές πρωτεΐνες α-συνουκλεΐνη και p25α αποικοδομούνται κυρίως από το λυσόσωμα τόσο σε κυτταρικές σειρές όσο και σε πρωτογενείς καλλιέργειες ολιγοδενδροκυττάρων υπό φυσιολογικές συνθήκες. Ταυτόχρονα, αναγνωρίσαμε ένα μοτίβο στην αλληλουχία της p25α το οποίο επιτρέπει την αποτελεσματική αποδόμηση της πρωτεΐνης μέσω της αυτοφαγίας διαμεσολαβούμενης από σαπερόνες σε ένα in vitro σύστημα απομονωμένων λυσοσσωμάτων προερχόμενων από εγκέφαλο επίμυος. Χρησιμοποιώντας ινιδιακές μορφές ανθρώπινης α-συνουκλεΐνης, χαρακτηρίσαμε διεξοδικά τη συμβολή του συστήματος αυτοφαγίας-λυσοσώματοςστην απομάκρυνση των εξωγενώς προστιθέμενων ινιδίων, αλλά και των επαγόμενων παθολογικών διαμορφώσεων της ενδογενούς ολιγοδενδρογλοιακής α-συνουκλεΐνης. Δείξαμε επίσης ότι η επώαση με ινίδια α-συνουκλεΐνης μειώνει την αυτοφαγική ροή και ότι η πρωτεΐνη p25α ασκεί μια ανασταλτική επίδραση στο μονοπάτι της μακροαυτοφαγίας, ενώ ταυτόχρονα η αυτοφαγία διαμεσολαβούμενη από σαπερόνες ενεργοποιείται ως αντισταθμιστικός μηχανισμός για να απομακρύνει τις παθολογικές μορφές α-συνουκλεΐνης που σχηματίζονται εντός τωνολιγοδενδροκυττάρων. Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη αναδεικνύει το σημαντικό ρόλο που διαδραματίζουν οι ενδογενείς ολιγοδενδρογλοιακές πρωτεΐνες α-συνουκλεΐνη και p25α στο σχηματισμό παθολογικών διαμορφώσεων α-συνουκλεΐνης σε πειραματικά μοντέλα της Ατροφίας Πολλαπλών Συστημάτων. Παράλληλα, αποκαλύπτει τη συμμετοχή της αυτοφαγίας διαμεσολαβούμενης από σαπερόνες και της μακροαυτοφαγίας στη ρύθμιση των επιπέδων τόσο της ενδογενούς ολιγοδενδρογλοιακής α-συνουκλεΐνης όσο και της p25α, σε φυσιολογικές και παθολογικές συνθήκες και προτείνει τη στόχευση αυτών των μονοπατιών ως πιθανούς θεραπευτικούς στόχους για τη νόσο.