Επίδραση της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης στην ομοιόσταση των νευρικών κυττάρων: συσχέτιση με τη νόσο του Parkinson

Abstract

The aim of the current study was the investigation of potential molecular mechanisms which underlie Parkinson’s disease pathogenesis. Parkinson’s disease is an age-related neurodegenerative disorder. It is characterized by the loss of a specific subtype of neurons, which reside in the substantia nigra pars compacta and project in the striatum. These neurons produce dopamine, a chemical substance that regulates motor function. Consequently, the dopaminergic neuronal loss is responsible for the motor dysfunction, the most prominent clinical feature of the disease.α-synuclein is as small protein, localized primarily in neurons. Although its physiological role remains unclear, it is widely known that it is the first protein to be both biochemically and genetically linked to Parkinson’s disease pathogenesis. According to relatively recent findings, α-synuclein can be found in the extracellular space, therefore the possibility for a paracrine mode of action exists.In order to decipher possible mechanisms via which extracellular α-synuclein elicits its pathogenic functions, we created a human cell-line, in which human wild type α-synuclein is expressed in high levels. We found that α-synuclein can be physiologically secreted in the culture medium of the overexpressing cells, via an unconventional secretory pathway, which depends on intracellular calcium and partly relies on a specific type of externalized vesicles, termed exosomes. Importantly, we showed that secreted forms of α-synuclein cause degeneration of neuronal cells, via a pathway that does not include internalization of the protein. Therefore, we sought to investigate a potential interaction of the secreted α-synuclein with the plasma membrane of the recipient cells, as an alternative neurotoxic mechanism. According to our results, the presence of secreted α-synuclein results in increased plasma membrane fluidity and augmented calcium entry. Moreover, we observed preferential sequestration of the excessive calcium in the mitochondria, which are key regulators of cellular metabolism and maintenance. It should be noted that the described events precede α-synuclein-induced neurodegeneration. At a later time point, which corresponds to the peak of α-synuclein-evoked neuronal death, we found a significant increase of calpain activity. Calpains are calcium-dependent proteases, which upon their activation can trigger downstream, death cascades. Lastly, by the use of specific chemical compounds, which either block calcium entry or chelate intracellular or extracellular calcium, we were able to spare cells from secreted α-synuclein adverse effects.Collectively our data reveal an etiological link between secreted α-synuclein-induced neurotoxicity and deregulation of calcium homeostatic machinery. Although these are preliminary data and further investigation is needed, one could argue that manipulation of calcium signaling cascades could represent a potential therapeutic target for Parkinson’s disease and related neyrodegenerative disorders.

Στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η διερεύνηση πιθανών μοριακών μηχανισμών που συντελούν στην παθογένεια της νόσου του Parkinson. Η νόσος του Parkinson είναι μία νευροεκφυλιστική ασθένεια, στενά συνδεδεμένη με το γήρας. Χαρακτηρίζεται από τον προοδευτικό εκφυλισμό συγκεκριμένων νευρώνων που εδράζονται στη μέλαινα ουσία του εγκεφάλου και απολήγουν στο ραβδωτό σώμα. Οι συγκεκριμένοι νευρώνες παράγουν το νευροδιαβιβαστή ντοπαμίνη, μία χημική ουσία η οποία, μεταξύ άλλων, ρυθμίζει και τη λειτουργία της κίνησης. Κατά συνέπεια, ο θάνατος των ντοπαμινεργικών νευρώνων, σχετίζεται άμεσα με τις κινητικές δυσλειτουργίες, που αποτελούν τον κυρίαρχο φαινότυπο των ασθενών με νόσο του Parkinson.Η α-συνουκλεΐνη, είναι μία μικρή πρωτεΐνη με κυρίαρχο εντοπισμό στα νευρικά κύτταρα. Παρότι ο φυσιολογικός της ρόλος παραμένει ακόμη προς διερεύνηση, είναι γνωστό ότι αποτελεί την πρώτη πρωτεΐνη που σχετίστηκε βιοχημικά και γενετικά με τη νόσο του Parkinson. Σχετικά πρόσφατα δεδομένα πιστοποίησαν την παρουσία της α-συνουκλεΐνης στον εξωκυττάριο χώρο, δίνοντας μία νέα διάσταση στις πιθανές δράσεις της.Προκειμένου να εξετάσουμε πιθανούς μηχανισμούς μέσω των οποίων η α-συνουκλεΐνη συμβάλλει στο νευροεκφυλισμό, δημιουργήσαμε μία ανθρώπινη κυτταρική σειρά, στην οποία η φυσικού τύπου ανθρώπινη α-συνουκλεΐνη, εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα. Παρατηρήσαμε, ότι η συγκεκριμένη πρωτεΐνη εκκρίνεται φυσιολογικά στο θρεπτικό μέσο των κυττάρων και μάλιστα, μέσω ενός μη κλασικού μηχανισμού έκκρισης, ο οποίος εξαρτάται από το ενδοκυττάριο ασβέστιο και, εν μέρει, περιλαμβάνει τη σύνδεσή της με μία κατηγορία κυστιδίων, που ονομάζονται εξωσώματα. Σημειωτέον, δείξαμε ότι οι εκκρινόμενες μορφές της α-συνουκλεΐνης προκαλούν εκφυλισμό σε νευρικά κύτταρα, χωρίς, ωστόσο, να ενδοκυτταρώνονται από αυτά. Έτσι, εξετάσαμε ως εναλλακτικό μηχανισμό νευροτοξικής δράσης της α-συνουκλεΐνης, την επίδρασή της στο επίπεδο της κυτταρικής μεμβράνης των κυττάρων-δεκτών. Σύμφωνα με τα αποτελέσματά μας, η παρουσία της α-συνουκλεΐνης αυξάνει τη ρευστότητα της πλασματικής μεμβράνης των κυττάρων-δεκτών, η οποία συνοδεύεται από παράλληλη αύξηση της εισροής των ιόντων ασβεστίου. Επιπλέον, παρατηρήσαμε συσσώρευση του πλεονάζοντος ασβεστίου στα μιτοχόνδρια, οργανίδια σημαντικά για το μεταβολισμό και την επιβίωση των κυττάρων. Να σημειωθεί ότι οι παραπάνω διαταραχές συμβαίνουν αρκετά νωρίς, πριν τα σημάδια του κυτταρικού θανάτου γίνουν εμφανή. Σε μεταγενέστερο χρονικό διάστημα, το οποίο συμπίπτει με την κορύφωση του εκφυλισμού, διαπιστώθηκε σημαντική αύξηση της ενεργοποίησης των καλπαϊνών, πρωτεασών, οι οποίες εξαρτώνται από το ενδοκυττάριο ασβέστιο και πυροδοτούν καταρροϊκά μονοπάτια θανάτου. Τέλος, με τη χρήση ειδικών φαρμακολογικών παραγόντων, που είτε παρεμποδίζουν την είσοδο του ασβεστίου στα κύτταρα είτε δεσμεύουν το εξωκυττάριο ή το ενδοκυττάριο ασβέστιο, μπορέσαμε να μειώσουμε την τοξική επίδραση της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης.Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, αποκαλύπτουν την ύπαρξη μίας αιτιολογικής σχέσης, μεταξύ της απορρύθμισης της ομοιόστασης των ιόντων ασβεστίου και της νευροτοξικής δράσης της α-συνουκλεΐνης. Κλείνοντας, τα παραπάνω ευρήματα, αν και πρωταρχικά, αναδεικνύουν τη ρύθμιση των σηματοδοτικών μονοπατιών του ασβεστίου, ως ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για τη νόσο του Parkinson, καθώς και συναφείς νευροεκφυλιστικές νόσους.