Ανακάλυψη νέων μεμβρανικών υποδοχέων και πρωτεϊνών ως φαρμακευτικών στόχων για τη θεραπεία του καρκίνου του μαστού

Abstract

Breast cancer (BC) is a highly heterogeneous disease encompassing multiple subtypes with different molecular and histopathological features, disease prognosis, and therapeutic responses. Among these, the Triple Negative BC form (TNBC) is an aggressive subtype with poor prognosis and therapeutic outcome. With respect to HER2 overexpressing BC, although advanced targeted therapies have improved the survival of patients, disease relapse and metastasis remains a challenge for therapeutic efficacy. In this study the aim was to identify key membrane-associated proteins which are overexpressed in these aggressive BC subtypes and can serve as potential biomarkers or drug targets. We leveraged on the development of a membrane enrichment protocol in combination with the global profiling GeLC-MS/MS technique, and compared the proteomic profiles of a HER2 overexpressing (HCC-1954) and a TNBC (MDA-MB-231) cell line with that of a benign control breast cell line (MCF-10A). An average of 2300 proteins were identified from each cell line, of which approximately 600 were membrane-associated proteins. Our global proteomic methodology in tandem with invigoration by Western blot and Immunofluorescence analysis, readily detected several previously-established BC receptors like HER2 and EPHA2, but importantly STEAP4 and CD97 emerged as novel potential candidate markers. This is the first time that the mitochondrial iron reductase STEAP4 protein up-regulation is linked to BC (HER2+ subtype), while for CD97, its role in BC has been previously described, but never before by a global proteomic technology in TNBC. STEAP4 was selected for further detailed evaluation by the employment of Immunohistochemical analysis of BC xenografts and clinical tissue microarray studies. Results showed that STEAP4 expression was evident only in malignant breast tissues whereas all the benign breast cases had no detectable levels. A functional role of STEAP4 intervention was established in HER2 overexpressing BC by pharmacological studies, where blockage of the STEAP4 pathway with an iron chelator (Deferiprone) in combination with the HER2 inhibitor Lapatinib led to a significant reduction in cell growth in vitro. Furthermore, siRNA mediated knockdown of STEAP4 also suppressed cell proliferation and enhanced the inhibition of Lapatinib in HER2 overexpressing BC, confirming its potential oncogenic role in BC. In conclusion, STEAP4 may represent a novel BC related biomarker and a potential pharmacological target for the treatment of HER2 overexpressing BC.Complementary approaches for the detection and quantification of well-known receptor targets associated with BC that cannot be readily detected in the discovery phase, such as GPCRs, were based on LC-MRM and LC-PRM methods. GPCRs play a central role in cell signaling and their implication in a variety of human cancers, makes them attractive targets for patient stratification and targeted therapies. In our effort to quantify low abundance GPCRs whose detection by antibody-based assays is challenging we have developed and applied Targeted LC-MS/MS-based approaches, such as Multiple Reaction Monitoring (MRM) and Parallel reaction monitoring (PRM), using representative BC and CaP cell lines. As a paradigm target we chose the Gonadotropin Releasing Hormone Receptor (GnRHR), an established therapeutic target for cancer therapy known to be overexpressed in BC and CaP. Our strategy for the quantification of GnRHR in cancer cells was based on the detection and measurement of the expression levels of synthetic proteotypic peptides. We managed to develop and validate an LC-MRM method for the detection and quantification of the mixture of the reference synthetic peptides of GnRHR, with the use of a Triple Quadrupole MS system. In order to further improve the sensitivity and the reproducibility of our methodology, we proceeded to the LC-PRM technique with the use of a high-resolution Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS. The LC-PRM method using a high-resolution MS system goes beyond LC-MRM in that it covers a wider dynamic concentration range with higher mass accuracy (ppm- to sub-ppm levels) and it can monitor all precursor to product transitions. As a result, the LC-PRM technique reduces the number of co-eluting peaks which generate interferences and leads to better sensitivity and reproducibility. Finally, by developing these methodologies we succeeded to determine accurately GnRHR expression levels in specific BC and CaP cell lines (MDA-MB-231, HCC-1954, MCF-7, WPE-NB26-3 και DU-145). In conclusion, our Targeted LC-MRM and LC-PRM strategies are anticipated to be of great importance in clinical practice since we could assess and monitor the expression levels of key receptor targets in cancer cells that could enable efficient and targeted pharmacologic interventions for cancer patients. The targeted proteomics approach can be applied to additional proteins of clinical importance that cannot be detected with antibody-based assays.

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί την πιο συχνή κακοήθεια και την δεύτερη κυρία αιτία θανάτου από καρκίνο στις γυναίκες παγκοσμίως, πλήττοντας τόσο τις ανεπτυγμένες όσο και τις αναπτυσσόμενες χώρες. Πρόκειται για μια εξαιρετικά ετερογενή ασθένεια που περιλαμβάνει πολλούς υποτύπους με διαφορετικά μοριακά και ιστοπαθολογικά χαρακτηριστικά, πρόγνωση και θεραπευτικό αποτέλεσμα. Μεταξύ αυτών, ο Τριπλά Αρνητικός καρκίνος του μαστού είναι από τους πιο επιθετικούς υποτύπους με κακή πρόγνωση και θεραπευτικό αποτέλεσμα. Όσον αφορά τον HER2+ καρκίνο του μαστού, αν και η ύπαρξη αρκετά αποτελεσματικών και στοχευμένων φαρμάκων έχει βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών, η υποτροπή και η μετάσταση της νόσου παραμένει μια πρόκληση ως προς τη θεραπευτική τους αντιμετώπιση. Επομένως, κρίνεται αναγκαία η ανακάλυψη νέων στοχευμένων φαρμακευτικών και διαγνωστικών παραγόντων για τον HER2+ και τον Τριπλά Αρνητικό καρκίνο του μαστού προκειμένου να επιτευχθούν τα βέλτιστα δυνατά θεραπευτικά αποτελέσματα. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση, ο προσδιορισμός και η εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης γνωστών και νέων υποψήφιων μεμβρανικών πρωτεϊνικών στόχων (υποδοχείς και πρωτεΐνες) που υπερεκφράζονται στον HER2+ και στον Τριπλά Αρνητικό καρκίνο του μαστού και οι οποίοι μπορούν να χρησιμεύσουν ως πιθανοί βιοδείκτες ή νέοι φαρμακολογικοί στόχοι. Βασικό εργαλείο στην προσπάθεια επίτευξης αυτού του στόχου ήταν η ανάπτυξη ενός συνδυασμού καινοτόμων Πρωτεομικών Μεθοδολογιών, χρησιμοποιώντας κυρίως την τεχνική της υγρής χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (HPLC-MS/MS). Για το σκοπό αυτό, αρχικά εφαρμόσαμε ένα ειδικό πρωτόκολλο απομόνωσης και εμπλουτισμού των μεμβρανικών πρωτεϊνών και στη συνέχεια προχωρήσαμε στην ανάλυση του πρωτεομικού προφίλ καλά χαρακτηρισμένων και αντιπροσωπευτικών κυτταρικών σειρών του μαστού: HCC-1954 (HER2+), MDA-MB-231 (Τριπλά Αρνητική) και MCF-10A (καλοήθη σειρά ελέγχου), χρησιμοποιώντας την αναλυτική τεχνική μαζικού προσδιορισμού GeLC-MS/MS. Ταυτοποιήθηκαν κατά μέσο όρο 2300 πρωτεΐνες από κάθε κυτταρική σειρά, εκ των οποίων περίπου οι 600 ήταν μεμβρανικές πρωτεΐνες. Η ενδελεχής στατιστική ανάλυση των πρωτεομικών μας δεδομένων υπέδειξε 110 και 191 υποψήφιες μεμβρανικές πρωτεΐνες-στόχους οι οποίες ήταν μοναδικές για την HCC-1954 και την MDA-MB-231 καρκινική κυτταρική σειρά, αντίστοιχα, σε σύγκριση με την φυσιολογική κυτταρική σειρά ελέγχου MCF-10A. Μεταξύ αυτών, καταφέραμε να προσδιορίσουμε καλά χαρακτηρισμένους υποδοχείς και φαρμακολογικούς στόχους στον καρκίνο του μαστού, όπως είναι οι EGFR, HER2 και EphA2, καθώς και νέους υποψήφιους μεμβρανικούς πρωτεϊνικούς στόχους, όπως οι STEAP4 και CD97. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν μέσω ανοσολογικών τεχνικών (Western Blot και ανοσοφθορισμού). Αυτή είναι η πρώτη φορά που η μιτοχονδριακή αναγωγάση του σιδήρου STEAP4 συνδέεται με τον καρκίνο του μαστού (HER2+ υπότυπος), ενώ για τον GPRC υποδοχέα CD97, ο ρόλος του στoν Τριπλά Αρνητικό καρκίνο του μαστού έχει περιγραφεί προηγουμένως, αλλά ποτέ πριν από μια μαζικού προσδιορισμού πρωτεομική τεχνολογία (GeLC-MS/MS). Ως εκ τούτου, η καινοτομία και η υψηλή έκφραση της STEAP4 στα HCC-1954 κύτταρα μας ώθησαν να την επιλέξουμε για περαιτέρω λειτουργική και φαρμακολογική μελέτη. Για να αξιολογηθεί η κλινική σημασία της STEAP4 σε καρκινικούς και φυσιολογικούς ιστούς του μαστού, πραγματοποιήθηκε αρχικά ανοσοϊστοχημική ανάλυσή της σε HCC-1954 και MDA-MB-231 όγκους ξενομοσχευμάτων και στη συνέχεια σε δύο καλά χαρακτηρισμένες μικροσυστοιχίες ιστών καρκίνου του μαστού (Tissue microarrays, TMAs). Αξιοσημείωτα, η έκφραση της STEAP4 βρέθηκε μόνο στους κακοήθεις ιστούς του μαστού ενώ όλοι οι καλοήθεις ιστοί ήταν αρνητικοί στην STEAP4. Επιπλέον, περίπου το 50% των καρκινικών περιπτώσεων εμφάνισε θετική έκφραση στην STEAP4, υποδεικνύοντας την εμπλοκή της στην παθογένεση του καρκίνου του μαστού. Εν συνεχεία, προχωρήσαμε στη φαρμακολογική αξιολόγησή της σε HER2+ καρκινικές σειρές (HCC-1954, SKBR3, BT474), χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό από έναν χηλικοποιητή σιδήρου, το Deferiprone, που μπορεί να αναστείλλει το σηματοδοτικό μονοπάτι της STEAP4 με έναν ευρέως χρησιμοποιούμενο HER2 αναστολέα, τη λαπατινίμπη. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική συνεργιστική αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού των HCC-1954, των SKBR3 και των ΒΤ474 κυττάρων, μετά από τη συγχορήγηση των δύο φαρμάκων, προτείνοντας έτσι ένα νέο πιθανό φαρμακολογικό σχήμα για την θεραπεία των ασθενών με HER2+ καρκίνο του μαστού. Τέλος, η αποσιώπηση της STEAP4 χρησιμοποιώντας μικρά δίκλωνα μόρια siRNAs οδήγησε επίσης σε σημαντική μείωση στην κυτταρική ανάπτυξη και ενίσχυση της κυτταροτοξικής και ανασταλτικής δράσης της λαπατινίμπης στα HCC-1954 κύτταρα, αποδεικνύοντας την άμεση εμπλοκή της STEAP4 στην κυτταρική ανάπτυξη των HER2+ καρκινικών κυττάρων του μαστού. Συμπερασματικά, η STEAP4 αποτελεί έναν νέο πιθανό βιοδείκτη και πολλά υποσχόμενο φαρμακευτικό στόχο για τη θεραπεία του HER2+ καρκίνου του μαστού.Συμπληρωματικές πρωτεομικές τεχνικές για την ανίχνευση αλλά και την εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης γνωστών και δύσκολα ανιχνεύσιμων μέσω μαζικής πρωτεομικής ανάλυσης μεμβρανικών υποδοχέων και πρωτεϊνών, όπως είναι οι GPCRs, βασίστηκαν στις στοχευμένες και ποσοτικές LC-MRM και LC-PRM τεχνικές. Οι υποδοχείς GPCRs δεν μπορούν να ανιχνευθούν εύκολα ούτε με την μαζικού προσδιορισμού GeLC-MS/MS αναλυτική τεχνική αλλά ούτε και με ανοσολογικές τεχνικές που βασίζονται σε αντισώματα, λόγω της χωροταξικής τους διαμόρφωσης στην κυτταρική μεμβράνη και της χαμηλής αφθονίας τους. Γι’αυτό το λόγο στραφήκαμε στις πιο ευαίσθητες και στοχευμένες προσεγγίσεις της φασματομετρίας μάζας LC-MRM και LC-PRM τεχνικές, χρησιμοποιώντας καλά χαρακτηρισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές. Στην προσπάθειά μας αυτή χρησιμοποιήσαμε ένα παράδειγμα GPCR υποδοχέα, τον GnRHR, o οποίος είναι καλά καθιερωμένος φαρμακευτικός στόχος στον καρκίνο του μαστού και του προστάτη. Η στρατηγική μας για την ανεύρεση και ποσοτικοποίηση του GnRHR σε καρκινικά κύτταρα βασίστηκε στην ανίχνευση και μέτρηση των επιπέδων έκφρασης συνθετικών πρωτοτυπικών πεπτιδίων που προέρχονται από την υπό μελέτη πρωτεΐνη-στόχο. Καταφέραμε να αναπτύξουμε και να επικυρώσουμε μια μέθοδο μLC-MRM και nanoLC-MRM για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό του μίγματος των πρότυπων συνθετικών πεπτιδίων αναφοράς του GnRHR, με τη χρήση ενός φασματομέτρου μάζας τύπου Τριπλού Τετραπόλου. Επιπλέον, για να βελτιώσουμε περαιτέρω την ευαισθησία και την ειδικότητα της μεθοδολογίας μας, προχωρήσαμε στην τεχνική LC-PRM με τη χρήση ενός υψηλής ανάλυσης φασματομέτρου μάζας τύπου Orbitrap. Τέλος, με αυτές τις μεθοδολογίες επιτύχαμε να ανιχνεύσουμε σημαντικά επίπεδα έκφρασης του GnRHR σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του μαστού και του προστάτη (MDA-MB-231, HCC-1954, MCF-7, WPE-NB26-3 και DU-145). Συμπερασματικά, οι στοχευμένες nanoLC-MRM και nanoLC-PRM στρατηγικές αναμένεται να έχουν μεγάλη σημασία στην κλινική πράξη καθώς θα μπορούσαμε να εκτιμήσουμε και να παρακολουθήσουμε τα επίπεδα έκφρασης βασικών πρωτεϊνικών στόχων στον καρκίνο, κάτι που θα μπορούσε να οδηγήσει σε πιο αποτελεσματική και στοχευμένη φαρμακολογική παρέμβαση και κατά συνέπεια στη βέλτιστη δυνατή θεραπευτική αντιμετώπιση επιθετικών υποτύπων καρκίνου με τις λιγότερο δυνατές τοξικότητες.