Μελέτη αντιμικροβιακής δράσης φυσικών προϊόντων

Abstract

Currently, there is a strong debate regarding the safety aspects of chemical preservatives added widely in most manufactured foods to prevent the growth of spoilage and pathogenic microbes. Hence, an increased interest in essential oils from various plant origins as alternative antimicrobial natural supplements to harmful synthetic additives is witnessed. In the present study, the antimicrobial activity of essential oils isolated from plants of the Lamiaceae [Origanum onites, Origanum dittamnus, Origanum vulgare ssp. hirtum (two chemotypes), Thymus capitatus, Satureja thymbra, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Siseritis raeseri subsp. raeseri], the Anacardiaceae (Pistacia lentiscus), the Apiaceceae (Pimpinella anisum), the Rutaceae (Citrus medica and Fortunella margarita) and the Verbenaceae family (Lippia citriodora), along with the main compounds of the oils was studied. Additionaly, the solid hydrostillation by-products of Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra were subjected to sequential Soxhlet extraction with ethyl acetate and ethanol and the antimicrobial potential of the obtained extracts, as well as the aqueous extracts after the hydrodistillation process of Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora and Fortunella margarita were assessed. The antimicrobial activity of the essential oils and the extracts was initially tested using the disk diffusion assay against common food spoilage and foodborne pathogens (Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fragi, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger). Subsequently, the minimun inhibitory concentration (MIC) and non inhibitory concentration (NIC) values for the essential oils, the extracts and the main compounds were determined using an established optical density method, which combined the absorbance measurements with the common dilution method and non-linear regression analysis was used to fit the data using a LPM model. The LPM model was not applicable to Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger due to yeast cell sedimentation and conidia flotation and thus the standard protocols described by The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) were applied for MIC determination. Minimum bactericidal concentration (MBC) or Minimun lethal concentration (MLC) values were also determined.All essential oils showed remarkable antimicrobial activity against all microbial species studied, except Pistacia lentiscus essential oil, which had no antimicrobial activity against Salmonella Enteritidis and Salmonella Typhimurium, the essential oil of Lippia citriodora, which was active only against gram (+) bacteria, and the essential oils of Fortunella margarita and Pimpinella anisum which had antimicrobial activity only against Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisiae. Solid by-products ethyl acetate and ethanol extracts of Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra were active against all bacteria species tested, but no activity against fungus and yeast was noted. Similarly, the aqueous extracts of Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora and Fortunella margarita had no antimicrobial avtivity. It is noteworthy that the essential oils were more active than the standard compounds, as significantly lower MIC, NIC and MBC or MLC values were determined. The solid by-products ethyl acetate extract (EAc), the ethanol extract (EtOH ) or the aqueous extract (Aq) of Satureja thymbra and the Origanum vulgare spp. hirtum essential oil were further tested as potential biopreservatives in food products. Aq, EAc or EtOH of S. thymbra were evaluated in salad dressings-like emulsions, while O. hirtum essential oil (OEO) was used to make emulsions that can be incorporated into final products, such as tomato juice. Spoilage of the products, as well as the antimicrobial activity of the bioactive ingredients after deliberate inoculation of the emulsions with 2 log cfu/mL Listeria monocytogenes and the tomato juice with 4 log cfu/mL Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae and 10000 spores/mL Aspergillus niger, separately were assessed. The results showed that both Satureja thymbra extracts and Origanum vulgare spp. hirtum acted as an efficient intrinsic inhibitor and prolonged the shelf life of the products, suppressing microbial growth after deliberate inoculation. Supplementation of tomato juice with OEO at concentration lower than MIC or only slightly higher than the NIC determined for Clostridium difficile was sufficient to suppress the growth of the deliberately inoculated microbes (Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger) suggesting a clear synergistic effect of the oil and the refrigeration temperature. Microorganisms are very often unable to overcome the combination of several food preservation systems and hence the multiple hurdles can result in a stable and safe product without any sensory quality deterioration. Similarly, the mixture (Mix) of essential oils of Pistacia lentiscus and Fortunella margarita, as well as the aqueous extract of Fortunella margarita, was tested as potential biopreservatives in ice creams and fruit flavored juices. From the mixture, in the ice creams, the essential oil of Pistacia lentiscus acted as possible biopreservative while essential oil of Fortunella margarita and the aqueous extract of Fortunella margarita as flavour enhancers. In the juices, Pistacia lentiscus and Fortunella margarita essential oils were used as biopreservatives, while the aqueous extract of Fortunella margarita was used as a flavor enhancer. In this vein, spoilage along with potential growth inhibition after deliberate inoculation with 4 log cfu/mL Escherichia coli, Listeria monocytogenes, or Pseudomonas fragi in the ice creams and 4 log cfu/mL Saccharomyces cerevisiae or 100 spores/mL Aspergillus niger in fruit juices were studied. The results showed significant delay of food spoilage and extension of the product’s shelf-life, as well as growth retardment of the inoculated species. The use of essential oils can be thus considered an additional intrinsic determinant (hurdle) to ensure food safety, although the limitations associated to their strong smell at effective doses and the decrease in their effectiveness when added to complicated food ecosystems compared with microbiological media. Τhe essential oils and the extracts of the aromatic plants studied are important sources of low cost antimicrobial agents that can be utilized by the food industry.

Τελευταία, γίνεται προσπάθεια για τη δραστική μείωση ή και εξάλειψη των χημικών συντηρητικών από τα τρόφιμα και την αντικατάστασή τους από φυσικά συντηρητικά, όπως τα αιθέρια έλαια. Τα αιθέρια έλαια είναι σύνθετα μίγματα πτητικών δευτερογενών μεταβολιτών από φυτά, με σημαντική αντιμικροβιακή δράση. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων που απομονώθηκαν από φυτά της οικογένειας Lamiaceae και συγκεκριμένα των Origanum onites, Origanum dittamnus, Origanum vulgare ssp. hirtum (δύο χημειότυποι), Thymus capitatus, Satureja thymbra, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Siseritis raeseri subsp. raeseri, της οικογένειας Anacardiaceae, (Pistacia lentiscus), της οικογένειας Apiaceceae (Pimpinella anisum), της οικογένειας Rutaceae (Citrus medica και Fortunella margarita) και της οικογένειας Verbenaceae (Lippia citriodora). Επίσης, μελετήθηκαν ως προς την αντιμικροβιακή τους δράση και ορισμένες από τις κύριες ενώσεις των αιθέριων ελαίων.Επιπλέον, τα στερεά υποπροϊόντα της υδροατμοαπόσταξης των Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra υποβλήθηκαν σε διαδοχική εκχύλιση Soxhlet με οξικό αιθυλεστέρα και αιθανόλη και τα εκχυλίσματα που ελήφθησαν μελετήθηκαν στη συνέχεια για πιθανή αντιμικροβιακή δράση. Επίσης, εξετάστηκαν τα υδατικά υπολείμματα υδροατμοαπόσταξης των Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora και Fortunella margarita. Η αντιμικροβιακή δράση των αιθέριων ελαίων, των εκχυλισμάτων και των υδατικών υπολειμμάτων μελετήθηκε αρχικά με τη δοκιμασία διάχυσης με χρήση δισκίων έναντι των κοινών αλλοιογόνων και τροφιμογενών παθογόνων μικροβιακών ειδών Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Listeria monocytogenes, Pseudomonas fragi, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Στη συνέχεια, προσδιορίστηκαν οι τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης (Minimum inhibitory concentration, MIC) και μη ανασταλτικής συγκέντρωσης (Νon-inhibitory concentration, NIC), συνδυάζοντας τις μετρήσεις της οπτικής πυκνότητας με τη κοινή μέθοδο των αραιώσεων και τη μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης (non-linear regression analysis), χρησιμοποιώντας το μοντέλο LPM.Το μοντέλο LPM δεν ήταν δυνατό να εφαρμοστεί στην περίπτωση των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger λόγω της καθίζησης των κυττάρων ζυμομύκητα και της επίπλευσης των κονιδίων του Aspergillus niger. Γι' αυτό, χρησιμοποιήθηκαν τα πρωτόκολλα που περιγράφονται από την Ευρωπαϊκή Επιτροπή (EUCAST) για τον προσδιορισμό των τιμών MIC των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Επίσης, προσδιορίστηκαν οι τιμές ελάχιστης βακτηριοκτόνου συγκέντρωσης (MBC) ή ελάχιστης θανατηφόρου συγκέντρωσης (MLC). Όλα τα αιθέρια έλαια εμφάνισαν αξιοσημείωτη αντιμικροβιακή δράση έναντι όλων των μικροβιακών ειδών που μελετήθηκαν, εκτός από το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus, το οποίο δεν είχε δράση έναντι των Salmonella Enteritidis και Salmonella Typhimurium, το αιθέριο έλαιο Lippia citriodora που ήταν ενεργό μόνο έναντι gram (+) βακτηρίων και τα αιθέρια έλαια Fortunella margarita και Pimpinella anisum που είχαν αντιμικροβιακή δράση μόνο κατά των Saccharomyces cerevisiae και Aspergillus niger. Τα εκχυλίσματα που προέκυψαν από τα στερεά υποπροϊόντα των Origanum onites, Origanum vulgare, Thymus capitatus και Satureja thymbra εμφάνισαν μόνο αντιβακτηριακή δράση. Απεναντίας, τα υδατικά εκχυλίσματα Satureja thymbra, Pistacia lentiscus, Pimpinella anisum, Citrus medica, Mentha spicata, Ocimum basilicum, Lippia citriodora και Fortunella margarita δεν είχαν αντιμικροβιακή δράση. Αξίζει να σημειωθεί ότι τα αιθέρια έλαια ήταν πιο δραστικά από τα βασικά συστατικά τους, καθώς προσδιορίστηκαν σημαντικά χαμηλότερες τιμές MIC, NIC και MBC ή MLC. Τα εκχυλίσματα οξικού αιθυλεστέρα (EAc) και αιθανόλης (EtOH) και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοαπόσταξης (Aq) του φυτού Satureja thymbra και το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη ως πιθανά βιοσυντηρητικά σε τρόφιμα, καθώς έδειξαν σημαντικές αντιμικροβιακές ιδιότητες. Τα εκχυλίσματα Satureja thymbra ενσωματώθηκαν σε γαλακτώματα που προσομοιάζουν σάλτσες για σαλάτες (salad dressings), ενώ το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum σε γαλακτωμάτων που μπορούν να ενσωματωθούν σε τελικά προϊόντα, όπως ο χυμός τομάτας και μελετήθηκε η φυσική αλλοίωση των προϊόντων, καθώς και η ανασταλτική δράση κυτταρικής ανάπτυξης μετά από εσκεμμένη επιμόλυνση των γαλακτωμάτων με 2 log cfu/mL Listeria monocytogenes και του τοματοχυμού με 4 log cfu/mL Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Saccharomyces cerevisiae ή 10000 σπόρια/mL Aspergillus niger. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τόσο τα εκχυλίσματα, εκτός από το υδατικό όσο και το αιθέριο έλαιο Origanum vulgare spp. hirtum παρέτειναν το χρόνο ζωής των προϊόντων και κατέστειλαν την μικροβιακή ανάπτυξη μετά από σκόπιμη επιμόλυνση. Η ενσωμάτωση αιθέριου ελαίου Origanum vulgare spp. hirtum στον τοματοχυμό σε συγκέντρωση χαμηλότερη από την τιμή MIC ή μόνο ελαφρώς υψηλότερη από την τιμή NIC που προσδιορίστηκε για το C. difficile ήταν αρκετή για να καταστείλει την ανάπτυξη των σκόπιμα εμβολιασμένων μικροβίων, γεγονός που υποδηλώνει συνεργιστική δράση ανάμεσα στο αιθέριο έλαιο και τη χαμηλή θερμοκρασία συντήρησης. Οι μικροοργανισμοί πολύ συχνά αδυνατούν να ξεπεράσουν το συνδυασμό πολλών συστημάτων συντήρησης και ως εκ τούτου τα πολλαπλά εμπόδια μπορούν να οδηγήσουν σε ένα σταθερό και ασφαλές προϊόν χωρίς αλλοίωση των οργανοληπτικών χαρακτηριστικών. Επιπλέον, το μίγμα (Mix) των αιθέριων ελαίων Pistacia lentiscus και Fortunella margarita, καθώς και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita δοκιμάστηκε ως πιθανό βιοσυντηρητικό σε προϊόντα παγωτών και χυμών φρούτων. Στα παγωτά το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus λειτούργησε ως πιθανό βιοσυντηρητικό ενώ το αιθέριο έλαιο Fortunella margarita, καθώς και το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita χρησιμοποιήθηκαν ως βελτιωτικά γεύσης. Στους χυμούς, σαν βιοσυντηρητικά χρησιμοποιήθηκαν το αιθέριο έλαιο Pistacia lentiscus και το αιθέριο έλαιο Fortunella margarita ενώ το υδατικό υπόλειμμα της υδροατμοπόσταξης του Fortunella margarita ως βελτιωτικό γεύσης. Αρχικά, εξετάστηκε η φυσική αλλοίωση των προϊόντων και στη συνέχεια μελετήθηκε η αναστολή κυτταρικής ανάπτυξης μετά από σκόπιμη επιμόλυνση των παγωτών με 4 log cfu/mL Escherichia coli, Listeria monocytogenes, ή Pseudomonas fragi και των χυμών με 4 log cfu/mL Saccharomyces cerevisiae ή 100 σπόρια Aspergillus niger/mL. Τα αποτελέσματα έδειξαν σημαντική καθυστέρηση της αλλοίωσης των τροφίμων και επέκταση της διάρκειας ζωής των προϊόντων, καθώς και αναστολή κυτταρικής ανάπτυξης σε όλες τις περιπτώσεις. Η χρήση αιθέριων ελαίων μπορεί επομένως να θεωρηθεί ένας πρόσθετος εγγενής ανασταλτικός παράγοντας (εμπόδιο) ανάπτυξης για τη διασφάλιση της ασφάλειας των τροφίμων, ξεπερώντας τους περιορισμούς που σχετίζονται με την έντονη οσμή τους σε αποτελεσματικές δόσεις όταν προστίθενται σε περίπλοκα συστήματα τροφίμων. Τα αιθέρια έλαια των αρωματικών φυτών που μελετήθηκαν μπορούν να χρησιμοποιηθούν σαν βιοσυντηρητικά ή να αποτελέσουν σημαντικές πηγές αντιμικροβιακών παραγόντων χαμηλού κόστους που μπορούν να αξιοποιηθούν από την βιομηχανία τροφίμων.