Μελέτη της παρστατίνης σε οφθαλμικά κύτταρα: in vitro μελέτη κυτταροτοξικότητας σε κύτταρα του αμφιβληστορειδούς

Abstract

Purpose: Parstatin, the N-terminal 41-amino-acid peptide cleaved by thrombin from protease-activated-receptor 1, was shown to be highly effective in preventing ocular angiogenesis and as such it has potential therapeutic applications in ocular neovascular diseases. In the frame of a safety program in preclinical development, we investigated whether parstatin exerts any cytotoxic effect in critical ocular cell populations. Materials and Methods: The 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay was used to compare the cytotoxicity of two parstatin peptides (full-length and truncated) on human and rat (ARPE-19 and R-Ret-508) cells in culture. The peptides were used for 24, 48 and 72 hours in a range of concentrations from 0.1μM to 30 μM.Results: Full-length parstatin (P1-41) significantly reduced the metabolic activity of ARPE-19 cells at 30 μM and 10 μM concentrations, with an approximate 50% decrease in viability after 24 and 72 hours of treatment, respectively. No effect on ARPE-19 viability was observed after treatment with the truncated parstatin peptide (P24-41) at any of the tested concentrations or periods of time. Full-length parstatin was also shown to reduce the metabolic activity of the primary rat retinal cells R-Ret-508 at 3 μM and 10 μM concentrations, with an approximate 50% in viability after 48 hours of treatment. Similar to ARPE-19 cells, no effect on viability was observed with the truncated parstatin peptide. Conclusions: Parstatin has a clear detrimental effect on the viability of retinal cells which appears to be time and dose-dependent. The results of this study raise concernsabout its use in the eye because of its possible toxic effects.

Στόχος: Η παρστατίνη, το Ν-τελικό πεπτίδιο 41-αμινοξέων που απελευθερώνεται μετά την πρωτεολυτική ενεργοποίηση του PAR 1 υποδοχέα της θρομβίνης, αποδείχθηκε εξαιρετικά αποτελεσματική στην πρόληψη της οφθαλμικής αγγειογένεσης και ως εκ τούτου έχει πιθανές εφαρμογές στις οφθαλμικές νεοαγγειακές παθήσεις. Στο πλαίσιο ενός προγράμματος ασφάλειας για προκλινική ανάπτυξη διερευνήθηκε εάν και κατά πόσο η παρστατίνη ασκεί κυτταροτοξική επίδραση σε ζωτικά οφθαλμικά κύτταρα. Υλικά και Μέθοδοι: Η χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) diphenyl tetrazolium bromide] χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση της κυτταροτοξικότητας δύο πεπτιδίων παρστατίνης (πλήρους μήκους και περικομμένου) σε ανθρώπινα κύτταρα ΑRPE-19 και σε R-Ret-508 κύτταρα αμφιβληστροειδούς αρουραίου σε καλλιέργεια. Τα πεπτίδια χρησιμοποιήθηκαν για 24, 48 και 72 ώρες σε ένα εύρος συγκεντρώσεων από 0.1 μΜ έως 30 μΜ. Αποτελέσματα: Η πλήρους μήκους παρστατίνη (Ρ 1-41) μείωσε σημαντικά τη μεταβολική δραστηριότητα των κυττάρων ARPE-19 σε συγκεντρώσεις 30 μΜ και 10 μΜ, με περίπου 50% μείωση της βιωσιμότητας μετά από 24 και 72 ώρες θεραπείας, αντίστοιχα. Ουδεμία επίδραση παρατηρήθηκε στη βιωσιμότητα των ARPE-19 κυττάρων μετά από θεραπεία με το περικομμένο πεπτίδιο παρστατίνης (Ρ 24-41) σε οποιαδήποτε από τις ελεγχόμενες συγκεντρώσεις ή χρονικές περιόδους. Η πλήρους μήκους παρστατίνη αποδείχθηκε επίσης ότι μειώνει τη μεταβολική δραστηριότητα των πρωτογενών αμφιβληστροειδικών κυττάρων αρουραίου R-Ret-508 σε συγκεντρώσεις 3 μΜ και 10 μΜ με περίπου 50% βιωσιμότητα μετά από 48 ώρες θεραπείας. Παρόμοια με τα κύτταρα ARPE-19, δεν παρατηρήθηκε επίδραση στη βιωσιμότητα με το περικομμένο πεπτίδιο παρστατίνης. Συμπέρασμα: Η παρστατίνη έχει σαφώς επιβλαβή επίδραση στη βιωσιμότητα των κυττάρων του αμφιβληστροειδούς που φαίνεται να εξαρτάται από το χρόνο και τη δόση. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης δημιουργούν ερωτηματικά σχετικά με τη χρήση της στον οφθαλμό λόγω των πιθανών τοξικών επιδράσεων.