Ο ρόλος των μιτωτικών κινασών στην ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση: λειτουργικός ρόλος της μιτωτικής κινάσης Haspin στα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα και τους γαμέτες

Abstract

Haspin is a Ser/Thr protein kinase that was originally discovered in mouse spermatocytes by Tanaka and coworkers in 1994. Since then, its function has been closely associated with mitotic divisions in somatic cells. Its functions include: a) phosphorylation of H3T3, b) regulation of CPC localization on mitotic centromeres during early prophase (through the H3T3ph-Survivin interaction), c) participation in centromeric cohesion protection between sister chromatids up to metaphase/anaphase transition (through the PIM motif on its amino-terminal sequence) and d) inhibition of transcription initiation during mitosis (through the Η3Τ3ph/H3K4me3 phospho-methyl switch). Haspin is expressed in pachytene spermatocytes and mitotically dividing tissues. According to various reports its RNA levels vary amongst tissues and tissue-cultured cells, while its promoter is differentially methylated in somatic tissues, germinal tissues and embryonic stem cell lines. The experimental results of this thesis have proven that Haspin regulates many aspects of both mouse embryonic stem cell and male gamete’s function. In the latter, its expression and/or activation are intermittent, since H3T3ph cannot be detected at several stages of the spermatogenic process. In the context of this thesis Haspin was initially detected in mitotic spermatogonia and meiotic spermatocytes, indirectly via H3T3ph. Centromeric regions and chromosome arms of mitotic spermatogonia were occupied by H3T3ph and this distribution pattern did not diversify from the first wave of spermatogenesis, to the adult steady state. The same modification was absent from prophase I and diakinesis of spermatocytes, but it was present in metaphase I and metaphase II. During the first meiotic division, It was detected in pericentromeric regions and between homologous chromosomes. This pattern gradually receded around centromeres from anaphase I, until the end of the second meiotic division. These data indicate that in the course of mitotic divisions of spermatogonia, Haspin is responsible for CPC localization and centromeric cohesion protection, as in somatic cells. Additionaly, it is possible that Haspin is involved in activation feedback loops and in assisting Rec8 concerning cohesion protection during meiotic divisions. After a period of absence, in the course of the spermatogenic cycle, H3T3ph reappeared in euchromatic regions of haploid spermatids, just before DNA hypercompaction was initiated at the head of the mature sperm. In parallel, it has been shown that Haspin knockout and overexpression, in mouse embryonic stem cells, affects spermatogenesis-related genes, such as SCML2 and DAZL. Those gene products have also been detected, along with H3T3ph, in the euchromatic regions of haploid late round and elongating spermatids, at steps 8-10. At the same time, the PMM motif was detected in mitotic and meiotic dividing cells of the testis. Competition assays have proven that the methyl- modifications of this motif are established earlier than the phosphorylation in haploid spermatids of stage V-VII and VIIIX tubules. The competition assays, in combination with the immunoprecipitation experiments have indicated that “poised chromatin” states exist in late spermatogenesis. These are depicted in alternating combinations of the PMM motif components. Methylation marks exist in earlier stages than phosphorylation, which appears in later. This indicates that H3T3ph is involved in chromatin compaction and transcription regulation. All the above data, have suggested that Haspin might have an auxiliary role in the mitotic machinery in somatic cells. Its main role could be that of a regulatory component of spermatogenesis. Specifically in haploid spermatids, Haspin could regulate the expression of spermatogenesis-specific genes and their repressors, through the formation of a phospho-methyl switch between H3T3ph, H3K4me3 and H3R8me2. Based on these data, it is of outmost importance to study the interaction of Haspin with regulatory proteins in a testis environment. The presence of equivocal modifications on the H3 tail and their role in regulating “poised chromatin” on promoter regions is well documented in the bibliography. Detailed characterization of the stages during which Haspin is expressed, through in situ hybridization assays, will provide answers for its exact role in gametogenesis.

Η Haspin είναι μια κινάση Ser/Thr που ανακαλύφθηκε σε σπερματοκύτταρα όρχεως ποντικού το 1994, από τους Tanaka et al. Έκτοτε η λειτουργία της έχει συνδεθεί με τη μιτωτική διαίρεση των σωματικών κυττάρων. Ο ρόλος της συνοψίζεται σε τέσσερα βασικά σημεία: α) τη φωσφορυλίωση της H3T3, β) τη συγκρότηση του CPC στα κεντρομερίδια κατά την έναρξη της μιτωτικής διαίρεσης (μέσω της σύνδεσης Η3Τ3ph-Survivin), γ) την προστασία της κεντρομεριδιακής συνοχής μεταξύ των αδελφών χρωματίδων έως τη μετάφαση/ανάφαση (μέσω του μοτίβου ΡΙΜ στο αμινο-τελικό της άκρο) και δ) την αναστολή της μεταγραφής κατά τη διάρκεια της μίτωσης (μέσω του Η3Τ3ph/H3K4me3 διακόπτη φωσφορυλίωσης/μεθυλίωσης). Εκφράζεται σε παχυταινικά σπερματοκύτταρα και μιτωτικά ενεργούς ιστούς. Σύμφωνα με την βιβλιογραφία, τα επίπεδα του RNA της παρουσιάζουν ετερογένεια μεταξύ ιστών και κυτταρικών τύπων, ενώ και ο υποκινητής της παρουσιάζει διαφορετικά επίπεδα μεθυλίωσης σε σωματικούς ιστούς, σε γαμετικούς ιστούς και σε σειρές βλαστικών κυττάρων. Τα δεδομένα της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποκαλύπτουν την πολύπλευρη λειτουργία της Haspin στα εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα και στους αρσενικούς γαμέτες του ποντικιού. Στους τελευταίους, η έκφραση ή/και η ενεργοποίησή της είναι διακοπτόμενη, καθώς μεσολαβούν χρονικά διαστήματα εντός της σπερματογένεσης όπου η φωσφωρυλίωση που καταλύει η συγκεκριμένη κινάση δεν ανιχνεύεται. Αρχικά, ταυτοποιήθηκε η παρουσία της σε μιτωτικά διαιρούμενα σπερματογόνια και μειωτικά διαιρούμενα σπερματοκύτταρα, διαμέσου της Η3Τ3ph. Στα μιτωτικά σπερματογόνια βρέθηκε σε περικεντρομεριδιακές περιοχές αλλά και στους βραχίονες των χρωμοσωμάτων. Η κατανομή αυτή δεν διαφοροποιήθηκε από το πρώτο κύμα της σπερματογένεσης, στα ενήλικα ποντίκια. Η ίδια τροποποίηση απουσίαζε από σπερματοκύτταρα κατά την πρόφαση Ι και τη διακίνηση, εντοπίστηκε όμως από τη μετάφαση Ι έως και τη μετάφαση ΙΙ. Ενώ στην πρώτη μειωτική διαίρεση εντοπίστηκε τόσο στις περικεντρομεριδιακές περιοχές, όσο και μεταξύ των ομόλογων χρωμοσωμάτων, η κατανομή της βρέθηκε να περιορίζεται σταδιακά πλησίον των κεντρομεριδίων από την ανάφαση Ι, μέχρι το τέλος της δεύτερης μειωτικής διαίρεσης. Τα παραπάνω ευρήματα δείχνουν ότι στις μιτωτικές διαιρέσεις των σπερματοκυττάρων είναι υπεύθυνη για τη συγκρότηση του CPC και την προστασία της συνοχής των αδελφών χρωματίδων, όπως και στα σωματικά κύτταρα. Ακόμη, είναι δυνατόν να υποβοηθά την ανατροφοδότηση του κύκλου ενεργοποίησης του CPC και την προστασία της συνοχής, σε συνεργασία με την Rec8, κατά τη διάρκεια των μειωτικών διαιρέσεων. Μετά από ένα διάστημα απουσίας κατά τον κύκλο ωρίμανσης του επιθηλίου του όρχεως, η H3T3ph βρέθηκε σε ευχρωματινικές περιοχές απλοειδών σπερματίδων πριν την έναρξη της υπερ-συμπύκνωσης του γενετικού υλικού στην κεφαλή του ώριμου σπέρματος. Παράλληλα, δείχθηκε ότι η απαλοιφή του γονιδίου της και η υπερέκφρασή του σε εμβρυονικά βλαστικά κύτταρα επηρεάζουν σημαντικά για τη σπερματογένεση γονίδια, όπως το SCML2 και το DAZL. Τα προϊόντα των γονιδίων αυτών βρέθηκαν να συνυπάρχουν με την H3T3ph στις ευχρωματινικές περιοχές όψιμων στρογγυλών και επιμηκυνόμενων σπερματίδων βήματος 8 έως 10. Ταυτόχρονα με τα παραπάνω, επιβεβαιώθηκε η παρουσία της τριπλής τροποποίησης PMM σε μιτωτικά και μειωτικά διαιρούμενα κύτταρα του όρχεως. Αποδείχθηκε ότι η εγκατάσταση των τροποποιήσεων μεθυλίωσης προηγείται της εγκατάστασης της φωσφωρυλίωσης που ολοκληρώνει την PMM-υπογραφή στις απλοειδείς σπερματίδες. Τα πειράματα ανταγωνιστικής αναστολής, σε συνδυασμό με την ανοσοκατακρήμνιση, έδειξαν ότι στους όρχεις υπάρχουν «ενδιάμεσες καταστάσεις χρωματίνης», οι οποίες αντικατοπτρίζονται στην εναλλαγή συνδυασμών του μοτίβου PMM. Η παρουσία των μεθυλιώσεων στους πρώιμους κυτταρικούς τύπους και της φωσφορυλίωσης στους όψιμους αναδεικνύει τη συμμετοχή της H3T3ph στους μηχανισμούς ελέγχου της συμπύκνωσης της χρωματίνης και της μεταγραφικής δραστηριότητας. Όλα τα παραπάνω δεδομένα, υπέδειξαν ότι ίσως η Haspin να έχει επικουρικό ρόλο στις μιτωτικές διαιρέσεις των σωματικών κυττάρων και κύριο στη ρύθμιση της σπερματογένεσης. Ειδικότερα, στις απλοειδείς σπερματίδες ίσως η H3T3ph, σε συνδυασμό με την H3K4me3 και την 3R8me2, να λειτουργεί ως διακόπτης ελέγχου της έκφρασης τόσο των γονιδίων στόχων, όσο και των καταστολέων τους. Σύμφωνα με τα προαναφερθέντα, κρίνεται σκόπιμο να διερευνηθεί η πιθανή αλληλεπίδρασης της Haspin με πρωτεΐνες-ρυθμιστές στο περιβάλλον του όρχεως. Η παρουσία αμφίσημων τροποποιήσεων στο αμινο-τελικό άκρο της ιστόνης Η3 και ο ρόλος τους στη διατήρηση μιας «ενδιάμεσης κατάστασης» στους υποκινητές γονιδίων που αυτές βρίσκονται είναι καλά τεκμηριωμένα στη βιβλιογραφία. Περαιτέρω έλεγχος της παρουσίας της Haspin στα διάφορα στάδια, με τεχνικές in situ υβριδισμού, θα δώσει απαντήσεις για το ρόλο της κατά τη γαμετογένεση.