Φυλογένεση, ταυτοποίηση και έλεγχος της ικανότητας ανάπτυξης αντοχής σε ανθελμινθικά φάρμακα των υποπληθυσμών του νηματώδους παρασίτου Haemonchus spp. στα μηρυκαστικά στην Ελλάδα

Abstract

The aim of the present study was to identify the species of the sympatric populations of the nematode parasite of the genus Haemonchus, which infect ruminants (sheep, goats, cattle, buffaloes) from different regions of Greece (continental and insular) by molecular methods. At the same time, an attempt was made to identify the possible subpopulations of Haemonchus spp. in Greece, to investigate their phylogenetic relationships as well as to determine the genetic diversity of each species. Finally, the possible development of anthelmintic resistance of the subpopulations of Haemonchus spp. in a widely used class of anthelmintic drugs, benzimidazoles, was tested. Two hundred eighty-eight worms of the genus Haemonchus were processed by molecular methods; of which 96 were collected from sheep, 96 from goats, 48 from cattle and finally, 48 from buffaloes. These worms were selected randomly aiming to the procession of worms from both continental and insular Greece. The head of each parasite, after being cut at the height of the cervical papillae, was processed with the classical phenol-chloroform protocol for DNA isolation. The nuclear ITS2 region was used for the identification of Haemonchus spp. The identification of Haemonchus spp. was based on the results of a study conducted by Stevenson et al. (1995). According to the same authors, the presence of adenine, guanine and adenine bases in positions 24, 205 and 219, respectively identify H. contortus while the presence of guanine, adenine and guanine bases in the same positions identify H. placei. In the present study, all sequences belonged to H. contortus. The mitochondrial NAD4 gene was used for the identification of the subpopulations of the nematode parasites H. contortus. In the present study, the total 194 sequences of the mitochondrial NAD4 gene of H. contortus were classified into 98 haplotypes. Phylogenetic analysis revealed the absence of clear grouping of the different haplotypes, depending on the species of ruminants, which the worms were collected from. In other words, this parasite can infect all species of ruminants when the right conditions are created. Moreover, the values of the haplotype and nucleotide diversity were higher in the population of H. contortus from small ruminants (sheep and goats) than the respective values from large ruminants (cattle and buffaloes). These values indicate a high diversity of mitochondrial NAD4 gene in H. contortus population of small ruminants and therefore, large gene flow between these parasites.Finally, the presence of benzimidazoles resistant H. contortus was investigated with an allele specific PCR, which detects a polymorphism (phenylalanine/tyrosine) that affects the amino acid at position 200 of the β-tubulin protein of these parasites. The frequencies of homozygous and heterozygous resistant genotypes at position 200 of the β-tubulin gene of H. contortus were 71.2% and 28.8%, respectively. Homozygous sensitive genotypes were not detected in any parasitic population. It is speculated that benzimidazole-resistant alleles were transferred to the parasitic population of large ruminants from that of small ruminants due to co-grazing.

Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η ταυτοποίηση των ειδών των συμπατρικών πληθυσμών του γένους Haemonchus, που προσβάλλουν τα μηρυκαστικά ζώα (πρόβατα, αίγες, βοοειδή, βουβάλια) από διαφορετικές περιοχές της Ελλάδας (ηπειρωτική και νησιωτική) με μοριακές μεθόδους. Παράλληλα, επιχειρήθηκε η αναγνώριση των πιθανών υποπληθυσμών των ειδών Haemonchus στην Ελλάδα, η διερεύνηση των φυλογενετικών σχέσεών τους καθώς και ο καθορισμός της γενετικής ποικιλομορφίας του κάθε είδους. Τέλος, ελέγχθηκε η πιθανή ικανότητα ανάπτυξης ανθελμινθικής αντοχής των υποπληθυσμών του συγκεκριμένου παρασίτου σε μία ευρέως χρησιμοποιούμενη κατηγορία ανθελμινθικών φαρμάκων, τις βενζιμιδαζόλες. Για τη διεξαγωγή των μοριακών δοκιμών χρησιμοποιήθηκαν 288 νηματώδη παράσιτα Haemonchus spp., εκ των οποίων τα 96 παράσιτα προέρχονταν από πρόβατα, τα 96 από αίγες, τα 48 από βοοειδή και τέλος, τα υπόλοιπα 48 από βουβάλια. Η επιλογή των δειγμάτων αυτών πραγματοποιήθηκε τυχαία με στόχο τη συμμετοχή στις μοριακές δοκιμές παρασίτων τόσο από την ηπειρωτική όσο και από τη νησιωτική Ελλάδα. Η κεφαλή του κάθε παρασίτου, μετά την αποκοπή της στο ύψος των ωτικών πτερυγίων, χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση του DNA, η οποία πραγματοποιήθηκε με το κλασικό πρωτόκολλο φαινόλης-χλωροφορμίου. H πυρηνική ITS2 περιοχή χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των ειδών των νηματωδών παρασίτων του γένους Haemonchus. Η ταυτοποίηση των ειδών των νηματωδών παρασίτων Haemonchus βασίστηκε στα αποτελέσματα της έρευνας των Stevenson et al. (1995), σύμφωνα με τους οποίους η παρουσία των βάσεων αδενίνης, γουανίνης και αδενίνης στις θέσεις 24, 205 και 219, αντίστοιχα ταυτοποιούν το είδος H. contortus, ενώ η παρουσία των βάσεων γουανίνης, αδενίνης και γουανίνης στις αντίστοιχες θέσεις ταυτοποιούν το είδος H. placei. Στην παρούσα έρευνα, όλες οι ακολουθίες ανήκαν στο είδος H. contortus. To μιτοχονδριακό NAD4 γονίδιο χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των υποπληθυσμών των νηματωδών παρασίτων H. contortus. Στην παρούσα έρευνα, οι 194 ακολουθίες του μιτοχονδριακού NAD4 γονιδίου των H. contortus ταξινομήθηκαν σε 98 απλότυπους. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε την απουσία σαφούς ομαδοποίησης των απλότυπων ανάλογα με τα είδη των ξενιστών, από τους οποίους συλλέχθηκαν τα παράσιτα. Με άλλα λόγια, το συγκεκριμένο παράσιτο μπορεί να προσβάλει αδιακρίτως όλα τα είδη των μηρυκαστικών όταν δημιουργηθούν οι κατάλληλες προϋποθέσεις. Επίσης, οι τιμές της απλοτυπικής και νουκλεοτιδικής ποικιλότητας στον πληθυσμό των H. contortus ήταν υψηλότερες συγκριτικά με τις αντίστοιχες τιμές των μεγάλων μηρυκαστικών. Το γεγονός αυτό υποδεικνύει αρκετά μεγάλη ποικιλομορφία σε επίπεδο μιτοχονδριακού NAD4 γονιδίου στον πληθυσμό των H. contortus από τα μικρά μηρυκαστικά και, συνεπώς, μεγάλη ανταλλαγή γονιδίων μεταξύ των συγκεκριμένων παρασίτων. Τέλος, διερευνήθηκε η παρουσία ανθεκτικών στις βενζιμιδαζόλες γενοτύπων H. contortus με τη μέθοδο της αλληλομορφοειδικής PCR, η οποία ανιχνεύει την παρουσία του πολυμορφισμού του αμινοξέως φαινυλαλανίνη/τυροσίνη στη θέση 200 της πρωτεΐνης της β-σωληνίνης των παρασίτων. Οι συχνότητες των ομόζυγων και ετερόζυγων ανθεκτικών γενοτύπων στη θέση 200 του γονιδίου της β-σωληνίνης των παρασίτων των μηρυκαστικών ήταν 71,2% και 28,8%, αντίστοιχα. Ομόζυγοι ευαίσθητοι γενότυποι δεν ανιχνεύθηκαν σε κανέναν παρασιτικό πληθυσμό. Πιθανολογείται ότι τα ανθεκτικά στις βενζιμιδαζόλες αλληλόμορφα μεταφέρθηκαν στον παρασιτικό πληθυσμό των μεγάλων μηρυκαστικών από τον αντίστοιχο των μικρών μηρυκαστικών εξαιτίας της βόσκησης σε κοινούς λειμώνες.