Ταυτοποίηση, φυλογένεση και καθορισμός των παραγόντων επικινδυνότητας των ειδών του γένους Cercopithifilaria, που προσβάλουν το σκύλο και τους κρότωνες στην Ελλάδα

Abstract

Species of the genus Cercopithifilaria have been little studied and they have a worldwide distribution. These parasites remained unknow to the scientific community for many years mainly due to the subcutaneous presence of the adult worms and the practical difficulties to find their microfilairae (Otranto et al., 2013a). Their bilogical cycle is indirect with hard ticks of the family Ixodidae acting as the only competing vectors (Winkhardt, 1980, Petit et al., 1988, Bain et al., 1986, Spratt and Haycock, 1988). In dogs there are three distinct species that they have been identified Cercopithifilaria bainae, Cercopithifilaria grassi and Cercopithifilaria sp. II. The presence of the adult nematodes in dogs and the dermal localiacation of their microfilariae have been associated with dermatitis and arthritis (Otranto et al., 2011a, Otranto et al., 2012a, Boyd et al., 2019, Soares et al., 2020a). Nowadays, the available scientific data regarding the canine Cercopithifilaria spp. are limited. In Greece the species Cercopithifilaria bainae have been identified in dogs in a pilot study conducted in the area of Thrace (Otranto et al., 2012b) and in ticks in a recent study which conducted only with the use of molecular tools (Latrofa et al., 2017b). Nevertheless, there are scant data regarding the exact geographical distribution, the species and genetic diversity of these filarioids in Greece.For the purpose of the present study, skin snips and ticks were collected from dogs from many geographical departments. In addition to this, individual parameters of each sampled dog were recorded for further statistical analysis. The study included the microscopic examination of the collected skin snips in order to detect the presence of dermal microfilariae and then morphologically identify them. In total, out of the 500 dogs, 70 (14%, CI 95%, 11 to 17%) were found to be positive for the presence of Cercopithifilari microfilariae. More precisely, 2 different species were identified, the species Cercopithifilaria bainae and Cercopithifilaria sp. II. In addition, another non-identified species was also detected. Moreover, the molecular analysis of the collected samples, including both skin snips and a representative number of ticks, was performed. This included the method of polymerase chain reaction (PCR) in order to amplify the specific mitochondrial gene cox1 (~304 bp). The samples which scored positive at PCR were further molecularly processed with the method of Sanger, in order to determine their sequences. Afterwards, the sequences were compared with those ones available in the GeneBank, using the BLAST online tool. The BLAST analysis of sequences obtained showed a high nucleotide identity ranging from 99 to 100% with those of C. bainae. In total 7 different haplotypes were identified. The most prevalent sequence type identified was represented by the haplotypes I followed by haplotype XVIII, haplotypes II and IX. Three new haplotypes named XIX, XX and XXI were identified with high nucleotide identity (99.58%) with those of C. bainae. The retrieved sequences were further processed for the phylogenetic analysis. In particular, the ML tree grouped all representative haplotypes in the large monophyletic clade of C. bainae supported by strong bootstrap value (99%). The risk factor analysis demonstrated that different individual parameters of dogs predispose them to the infection with species of Cercopithifilaria. Among these risk factors are included the body weight, the living conditions, the previous history of tick infestation and the previous ecto-parasite treatments. Further studies are essential regarding the epidemiology and the geographical distribution of these filarioids as well as in order to better understand their pathogenicity, their life cycle and their high genetic biodiversity. Finally, the veterinarians should be well-informed regarding the presence of these parasites and the available methods of diagnosis and prevention.

Τα είδη του γένους Cercopithifilaria, που προσβάλλουν τον σκύλο, δεν έχουν μελετηθεί εκτενώς μέχρι σήμερα, αν και έχουν διαπιστωθεί σποραδικά σε αρκετές χώρες. Η φιλαρίωση αυτή παρέμεινε για αρκετά χρόνια άγνωστη, λόγω της υποδόριας εντόπισης των ενηλίκων παρασίτων και της πρακτικής δυσκολίας ανίχνευσης των μικροφιλαριών (Otranto et al., 2013a). Ο βιολογικός κύκλος είναι έμμεσος, με ενδιάμεσο ξενιστή τους κρότωνες της οικογένειας Ixodidae (Winkhardt, 1980, Petit et al., 1988, Bain et al., 1986, Spratt and Haycock, 1988). Στο σκύλο έχουν ταυτοποιηθεί 3 είδη, τα Cercopithifilaria bainae, Cercopithifilaria grassi και Cercopithifilaria sp. II. Η παρουσία των ενηλίκων παρασίτων στον σκύλο και η εντόπιση των μικροφιλαριών στην επιδερμίδα, έχουν συσχετισθεί με διάφορες παθολογικές καταστάσεις όπως η δερματοπάθεια, υποδόρια κύστη και η αρθροπάθεια (Otranto et al., 2011a, Otranto et al., 2012a, Boyd et al., 2019, Soares et al., 2020a). Σήμερα, τα δεδομένα σχετικά με την Cercopithifilaria spp., που προσβάλλει τον σκύλο, είναι περιορισμένα παγκοσμίως. Στη χώρα μας το είδος Cercopithifilaria bainae έχει βρεθεί σε σκύλους σε μια πιλοτική έρευνα, που πραγματοποιήθηκε μόνο σε μια περιοχή της Θράκης (Otranto et al., 2012b), καθώς και σε κρότωνες, που συλλέχθηκαν από σκύλους και εξετάστηκαν, μόνο με τη χρήση μοριακών μεθόδων (Latrofa et al., 2017b). Ωστόσο, υπάρχει ένδεια επιστημονικών δεδομένων, σχετικά με τη γεωγραφική κατανομή, την ταυτοποίηση των ειδών και τη γενετική ποικιλομορφία του παρασίτου αυτού στην Ελλάδα. Στην παρούσα μελέτη με σκοπό τη διερεύνηση της γεωγραφικής κατανομής του παρασίτου, συλλέχθηκαν δείγματα ιστοτεμαχίων δέρματος και κρότωνες από σκύλους. Ταυτόχρονα με τη συλλογή των δειγμάτων, πραγματοποιήθηκε η καταγραφή όλων των ατομικών στοιχείων του κάθε σκύλου με σκοπό τη περαιτέρω στατιστική ανάλυση. Η μελέτη περιελάμβανε τη μικροσκοπική εξέταση των ιστοτεμαχίων δέρματος, με σκοπό την ανεύρεση των δερματικών μιρκοφιλαριών και τη μορφολογική ταυτοποίηση τους. Συνολικά από τους 500 σκύλους οι 70 (14%, CI 95%, 11 to 17%) βρέθηκαν να είναι μολυσμένοι με δερματικές φιλάριες του γένους Cercopithifilariα. Συγκεκριμένα, ταυτοποιήθηκαν 2 είδη, το είδος Cercopithifilaria bainae και Cercopithifilaria sp. II. Επίσης, ταυτοποιήθηκε μορφολογικά ένα επιπλεόν αταυτοποίητο είδος Cercopithifilaria. Ακόμα, πραγματοποιήθηκε η μοριακή ανάλυση των ιστοτεμαχίων δέρματος, καθώς και ενός αντιπροσωπευτικού δείγματος από τους συλλεχθέντες κρότωνες, με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), με σκοπό την ενίσχυση του μιτοχονδριακού γονιδίου cox1 (~304 ζεύγη βάσεων). Τα δείγματα, τόσο των ιστοτεμαχίων δέρματος, όσο και των κροτώνων, που βρέθηκαν θετικά στην παρουσία Cercopithifilaria, με τη μέθοδο της PCR, επεξεργάσθηκαν περαιτέρω με τη μέθοδο Sanger, κατά την οποία προσδιορίστηκε η νουκλεοδιτική αλληλουχία του γονιδίου cox1. Στη συνέχεια, επεξεργάστηκαν περαιτέρω, με σκοπό την πολλαπλή στοίχιση τους, χρησιμοποιώντας το ειδικό αυτοματοποιημένο λογισμικό βιοπληροφορικής BLAST (Basic Logic Alignment Serach Tool). Τα αποτελέσματα, που προέκυψαν από την ανάλυση, έδειξαν πως υπήρχε υψηλή νουκλεοτιδική συγγένεια με τις αλληλουχίες cox1 (99% με 100%) τού είδους C. bainae. Από τη μέθοδο BLAST προσδιορίστηκαν 7 συνολικά διαφορετικοί απλότυποι. Ο πιο συχνός απλότυπος ήταν ο απλότυπος I, ο απλότυπος XVIII, και εν συνεχεία ο απλότυπος II και IX. Επιπροσθέτως, ταυτοποιήθηκαν τρεις νέοι απλότυποι, XIX, XX και XXI με υψηλή νουκλεοτιδική συγγένεια (99,58%) με τις αλληλουχίες cox1 του είδους C. bainae. Οι αλληλουχίες, που προέκυψαν από τη μέθοδο Sanger, επεξεργάστηκαν με σκοπό τη φυλογενετική ανάλυση. Το φυλογενετικό δένδρο που προέκυψε, ομαδοποίησε όλους τους απλοτύπους, που βρέθηκαν στην παρούσα εργασία, σε ένα μονοφυλετικό κλάδο του είδους C. bainae, γεγονός που υποστηρίζεται επιπλέον, από τη σχετικά υψηλή τιμή του παράγοντα bootstrap (99%). Από τη στατιστική ανάλυση για τη διερεύνηση των διαφόρων παραγόντων επικινδυνότητας, προέκυψε πως διάφοροι ατομικοί παράγοντες των σκύλων σχετίζονται και προδιαθέτουν για μόλυνση, από τα είδη Cercopithifilaria. Ανάμεσα στους διαφόρους παράγοντες επικινδυνότητας συμπεριλαμβάνονται, ο χώρος διαβίωσης, το βάρος, το ιστορικό προσβολής από κρότωνες, καθώς και η χρήση εξω-παρασιτοκότνων σκευασμάτων. Η περαιτέρω μελέτη της επιδημιολογίας και γεωγραφικής κατανομής των παρασίτων Cercopithifilaria, καθώς και η διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών παθογένειας, του βιολογικού κύκλου και της μεγάλης γενετικής ποικιλομορφίας είναι αναγκαία, με σκοπό να απαντηθούν αρκετά ερευνητικά ερωτηματικά. Τέλος, τονίζεται η ανάγκη για ενημέρωση των κτηνίατρων της χώρας, σχετικά με την παρουσία των νηματωδών παρασίτων στους σκύλους και τις διαθέσιμες μεθόδους διάγνωσης και πρόληψης.