Study and characterization of enzymes and metabolic pathways involved in the decomposition of lignin and lignin-derived compounds

Abstract

Lignocellulose biorefineries can harness the immense amounts of reduced carbon in the structural components of plant cell walls, via the conversion of residual biomass into biofuels and bio-based chemicals. The use of bacterial enzymes for lignocellulose valorization has recently gained growing attention and has been proposed as an alternative approach to the current use of fungal hydrolytic enzymes, due to the lower production cost of bacterial enzymes and their higher stability against the harsh conditions usually employed in biorefineries. Moreover, bacteria naturally endowed or engineered with the ability to funnel diverse lignin-derived molecules into specific high added-value products can replace chemical processes for lignin valorization. The aims of this thesis were to discover novel lignin and plant polysaccharide degrading bacteria, to detect efficient hydrolytic and oxidative enzymes and to elucidate pathways involved in bacterial degradation of lignin. The outcomes of this thesis are expected to aid the efforts towards designing efficient enzymatic and microbial biocatalysts for the complete valorization of lignocellulosic biomass. To detect aerobic, mesophilic bacterial lignocellulose degraders, five uniformly distributed surface soil samples were collected from Keri Lake, at the island of Zakynthos, in western Greece. This area represents a unique environment, dominated by a marsh mainly composed of reeds, with increased biomass degradation, where, in parallel, for more than 2.500 years asphalt springs release crude oil, rich in aromatic hydrocarbons. For the isolation of bacteria, an enrichment strategy based on organosolv lignin, xylan from birchwood and carboxymethyl amorphous cellulose (CMC), as sole carbon and energy sources was used. A total of 63 colonies were isolated from enrichment cultures of all five soil samples. Characterization of the 16S rRNA gene of all the isolates generated 24 different genera. A wide diversity of Pseudomonas species was enriched in organosolv lignin cultures. Complex bacterial consortia were enriched in cultures with xylan or CMC, belonging to Actinobacteria, Proteobacteria, Bacilli, Sphingobacteriia and Flavobacteria. Several individual isolates could target amorphous and crystalline cellulose, or xylan, by expressing the corresponding hydrolytic activities, providing evidence of endoglycolytic, exoglycolytic and xylanolytic enzyme activity. A series of screening tests have featured the ability of strain Pseudomonas kilonensis ZKA7 to grow on organosolv lignin, on lignin hydrolysates generated from agricultural residues of corn stover and wheat straw, by implementing a mild alkali pretreatment method, and on lignin-derived aromatic monomers such as ferulic, caffeic and vanillic acid. NMR analysis revealed that this strain was also able to generate structural modifications in corn stover lignin hydrolysate, arising from degradation of lignin aromatic moieties. Three novel oxidoreductases from strain ZKA7 were selected for investigation of their ligninolytic and oxidative potential, a multicopper oxidase (Pk-CopA), a dye decolorizing peroxidase (Pk-DypB) and a catalase-peroxidase (Pk-katG). The recombinant proteins were expressed as N-terminal 6xHis-fusion proteins in E. coli expression system and were purified by nickel affinity chromatography and gel filtration chromatography. Pk-CopA was able to oxidize lignin prepared from alkali pretreated corn stover, in the presence of ABTS as a mediator, generating a new product, as indicated by HPLC analysis. It was also able to oxidize the lignin-associated aromatic monomers ferulic acid, caffeic acid, syringic acid and catechol. Pk-CopA exhibited activity at a higher pH range than most bacterial laccases, retaining over 80% of its optimal activity between pH 4.5 - 6.5. It also exhibited high pH and thermal stability, maintaining 80% of its initial activity after 2 h of preincubation at pH 11and almost 70% of its initial activity within 6 hours of incubation at 60°C.Pk-DypB was active towards ABTS, while it was able to act at a less acidic pH (6.0) than other characterized dyp-type peroxidases. However, its thermal stability and pH stability under alkaline and acidic conditions were lower than other enzymes. Under the conditions tested, no oxidative activity was detected for Pk-DypB towards lignin hydrolysate from alkali pretreated corn stover. Pk-KatG exhibited both catalase and peroxidase activity though it exhibited higher affinity and catalytic efficiency towards peroxidase substrates than the natural catalase substrate, H2O2. The biochemical characterization of Pk-KatG also provides the first report of the oxidation of syringaldazine, a typical substrate of ligninolytic enzymes, by a catalase-peroxidase, as well as the first report of the oxidation of the aromatic monomers catechol and pyrogallol, mediated by the presence of ABTS, and the oxidation of the synthetic dye Remazol Brilliant Blue R, a substrate used to detect ligninolytic activity. These findings may suggest a potential lignin oxidative activity that remains to be investigated. For the identification of pathways involved in lignin degradation a proteomic analysis was conducted on Pseudomonas kilonensis ZKA7 cells, grown on lignin hydrolysate from corn stover, ferulic, caffeic, and vanillic acid, and acetate as a reference substrate. Protein samples were collected from cells grown on each substrate, separated into intracellular and extracellular fractions and subjected to proteomic analysis, using an LC-MS/MS system. Statistical analysis revealed the upregulation of genes involved in upper and central pathways of lignin-derived aromatic monomers degradation, as well as genes encoding transport proteins, transcriptional regulators, stress response proteins, oxidative enzymes and proteins of unknown function.

Η λιγνινοκυτταρινούχος βιομάζα αποτελεί μία άφθονη και ανανεώσιμη πηγή ανηγμένου άνθρακα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών τα οποία μέχρι σήμερα παράγονται από το πετρέλαιο. Στα πλαίσια ενός βιοδιυλιστηρίου δεύτερης γενιάς το λιγνινοκυτταρινούχο φυτικό υλικό υπόκειται αρχικά σε προκατεργασία προκειμένου να απομακρυνθεί η λιγνίνη και να αποκτήσουν τα υδρολυτικά ένζυμα πρόσβαση στους πολυσακχαρίτες του φυτικού κυτταρικού τοιχώματος. Τα υδρολυτικά ένζυμα απελευθερώνουν σάκχαρα τα οποία στη συνέχεια ζυμώνονται από μικροοργανισμούς, προς παραγωγή βιοκαυσίμων και χημικών. Έως σήμερα, η λιγνίνη που απομακρύνεται παραμένει σε μεγάλο ποσοστό ανεκμετάλλευτη, ενώ τα μυκητιακής φύσεως υδρολυτικά ένζυμα που χρησιμοποιούνται, έχουν αυξημένο κόστος παραγωγής και παρουσιάζουν χαμηλή σταθερότητα στις αντίξοες συνθήκες ενός βιοδιυλιστηρίου. Η χρήση βακτηρίων που διαθέτουν μεταβολικά μονοπάτια αποικοδόμησης της λιγνίνης και των παραγώγων της αλλά και η χρήση εξειδικευμένων βακτηριακών ενζύμων διάσπασης της λιγνίνης αποτελούν εναλλακτικές μεθόδους αξιοποίησης της λιγνίνης προς την κατεύθυνση της παραγωγής προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας. Η χρήση βακτηριακών υδρολυτικών ενζύμων έχει επίσης προταθεί ως εναλλακτική της χρήσης των μυκητιακών, εξαιτίας του χαμηλότερου κόστους παραγωγής των βακτηριακών ενζύμων και της υψηλότερης σταθερότητάς τους σε υψηλές θερμοκρασίες και ακραίες τιμές pH. Ο στόχος αυτής της διατριβής είναι η ανεύρεση νέων βακτηρίων και ενζύμων με ικανότητα αποικοδόμησης της λιγνίνης, η μελέτη του μηχανισμού της βακτηριακής διάσπασης της λιγνίνης και των αρωματικών μονομερών της, και η εξεύρεση βακτηριακών ενζύμων που υδρολύουν την κυτταρίνη και τις ημικυτταρίνες. Τα αποτελέσματα αυτής της έρευνας αναμένεται να βοηθήσουν την προσπάθεια σχεδιασμού αποτελεσματικών μικροβιακών και ενζυμικών βιοκαταλυτών και την εφαρμογή τους για την πλήρη αξιοποίηση της λιγνινοκυτταρινούχου βιομάζας. Για την απομόνωση αερόβιων, μεσόφιλων βακτηρίων με ικανότητα διάσπασης των συστατικών της λιγνινοκυτταρίνης, χρησιμοποιήθηκαν πέντε επιφανειακά εδαφικά δείγματα της περιοχής Λίμνη Κεριού, από το νησί της Ζακύνθου, τα οποία προστέθηκαν σε καλλιέργειες εμπλουτισμού με μοναδικές πηγές άνθρακα και ενέργειας τη λιγνίνη organosolv, την ξυλάνη σημύδας ή την άμορφη κυτταρίνη CMC. Η περιοχή του Κεριού αποτελεί ένα ιδιαίτερο ενδιαίτημα όπου παρατηρείται εκτεταμένη αποικοδόμηση της φυτικής βιομάζας και κατά τόπους φυσική ανάβλυση πετρελαίου με διαπιστωμένα υψηλό ποσοστό αρωματικών υδρογονανθράκων. Από το σύνολο των πέντε εδαφικών δειγμάτων απομονώθηκαν 63 αμιγείς αποικίες, οι οποίες βάση του χαρακτηρισμού του 16S rRNA γονιδίου ανήκουν σε 24 διαφορετικά γένη. Ένα ευρύ φάσμα βακτηρίων που ανήκουν στο γένος Pseudomonas απομονώθηκαν από καλλιέργειες σε λιγνίνη organosolv, και ποικίλα στελέχη που ανήκουν στα φύλα Actinobacteria, Proteobacteria, Bacilli, Sphingobacteriia και Flavobacteria απομονώθηκαν από καλλιέργειες ξυλάνης και κυτταρίνης, με κυρίαρχα τα είδη του γένους Microbacterium. Για τη μελέτη ανάπτυξης των βακτηριακών στελεχών σε υποστρώματα λιγνίνης παρασκευάστηκαν υδρολύματα λιγνίνης από άχυρο καλαμποκιού και σιταριού, χρησιμοποιώντας μία ήπια αλκαλική μέθοδο προκατεργασίας. Παράλληλα, εξετάστηκε η ικανότητα ανάπτυξης των στελεχών σε εμπορικά σκευάσματα λιγνίνης organosolv και kraft λιγνίνης καθώς και σε πρότυπες μονομερείς και διμερείς αρωματικές ενώσεις λιγνίνης. Σημαντικός αριθμός στελεχών αναπτύχθηκαν στα υποστρώματα λιγνίνης από προκατεργασμένα αγροτικά υπολείμματα. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν το στέλεχος Pseudomonas kilonensis ZKA7 το οποίο είναι ικανό να αναπτύσσεται σε λιγνίνη από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο καλαμποκιού και σιταριού, σε λιγνίνη organosolv, και στα αρωματικά μονομερή φερουλικό, καφεϊκό και βανιλλικό οξύ. Η ανάλυση με NMR πρωτονίων έδειξε ότι το στέλεχος αυτό επιφέρει δομικές αλλαγές στο υδρόλυμα λιγνίνης από προκατεργασμένο άχυρο καλαμποκιού, και συγκεκριμένα μείωση των κορυφών που αντιστοιχούν στα αρωματικά πρωτόνια. Επίσης, το στέλεχος Pseudomonas sp. ZKA12 είναι ικανό να μεταβολίζει μονομερή λιγνίνης τύπου G- και S-, όπως φερουλικό και συρινγκικό οξύ, και μπορεί να αποτελέσει τη βάση για το μελλοντικό σχεδιασμό ενός μικροοργανισμού που θα αποικοδομεί όλα τα δομικά συστατικά της λιγνίνης. Αρκετά στελέχη ήταν ικανά να αποικοδομούν τη CMC κυτταρίνη, την μικροκρυσταλλική κυτταρίνη Avicel και την ξυλάνη σημύδας σε αμιγείς καλλιέργειες, υποδηλώνοντας τη δράση ενδογλουκανασών, εξωγλουκανασών και ξυλανασών, ωστόσο από το σημείο αυτό και έπειτα η έρευνα επικεντρώθηκε στην μελέτη της διάσπασης της λιγνίνης. Τρία οξειδοαναγωγικά ένζυμα του στελέχους ΖΚΑ7 επιλέχθηκαν για τη διερεύνηση της λιγνινολυτικής και οξειδωτικής τους ικανότητας. Συγκεκριμένα, τα ένζυμα αυτά ήταν μία πολυοξειδάση χαλκού (Pk-CopA), μία υπεροξειδάση αποχρωματισμού χρωστικών τύπου Dyp (Pk-DypB) και μία καταλάση-υπεροξειδάση (Pk-katG). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες παρήχθησαν σε σύστημα υπερέκφρασης E. coli και ο καθαρισμός τους πραγματοποιήθηκε με χρωματογραφία συγγένειας και χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού. Η πρωτεΐνη Pk-CopA είχε χαρακτηριστικά λακκάσης και οξείδωσε τη λιγνίνη από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο, παρουσία ABTS ως ενδιάμεσου μορίου. Επίσης, εμφάνισε ικανότητα οξείδωσης των αρωματικών μονομερών φερουλικό, καφεϊκό και συρινγκικό οξύ καθώς και της κατεχόλης. Η Pk-CopA είχε ενεργότητα σε ένα μεγαλύτερο εύρος pH σε σχέση με τις περισσότερες βακτηριακές λακκάσες, και επέδειξε υψηλή σταθερότητα σε θερμοκρασίες 60-70°C, και υψηλή σταθερότητα σε αλκαλικό pH, χαρακτηριστικά που καθιστούν το ένζυμο ικανό να αξιοποιηθεί σε διεργασίες ενός βιοδιυλιστηρίου. Η πρωτεΐνη Pk-DypB εμφάνισε άριστο pH δράσης στην όξινη περιοχή, αλλά σε μεγαλύτερη τιμή σε σύγκριση με χαρακτηρισμένες υπεροξειδάσες τύπου dyp, ωστόσο, η σταθερότητά της σε υψηλές θερμοκρασίες και αλκαλικό και όξινο pH ήταν χαμηλότερη από παρόμοια ένζυμα. Υπό τις εξεταζόμενες συνθήκες, δεν ανιχνεύτηκε οξειδωτική δράση έναντι της λιγνίνης που παρασκευάστηκε από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο. Η πρωτεΐνη Pk-KatG είχε δράση καταλάσης και υπεροξειδάσης ενώ επέδειξε υψηλότερη συγγένεια και καταλυτική ικανότητα έναντι οργανικών υποστρωμάτων υπεροξειδασών , σε σχέση με το υπεροξείδιο υδρογόνου που αποτελεί φυσικό υπόστρωμα για τις καταλάσες. Η Pk-KatG οξείδωσε το πρότυπο αρωματικό υπόστρωμα syringaldazine και τη συνθετική χρωστική Remazol Brilliant Blue R, υποδηλώνοντας πιθανή λιγνινολυτική δράση του ενζύμου. Τέλος, η πρωτεομική ανάλυση του στελέχους Pseudomonas kilonensis ZKA7 έδειξε ότι τα γονίδια που εμπλέκονται σε περιφερειακά και κεντρικά μονοπάτια αποδόμησης αρωματικών μονομερών της λιγνίνης είναι μεταβολικά ενεργά και επάγονται παρουσία λιγνίνης από αλκαλικά προκατεργασμένο άχυρο. Επίσης, η πρωτεομική ανάλυση ανέδειξε την αυξορύθμιση γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεϊνικούς μεταφορείς, μεταγραφικούς παράγοντες, πρωτεΐνες απόκρισης στο οξειδωτικό στρες, οξειδωτικά ένζυμα και πρωτεΐνες άγνωστης έως τώρα λειτουργίας, των οποίων ο ρόλος αναμένεται να διερευνηθεί μέσα από περαιτέρω πειράματα.