Μελέτη της αιτιοπαθογένειας της λειτουργικής υποθαλαμικής αμηνόρροιας: συσχέτιση με παράγοντες συμπεριφοράς και γονιδιακές μεταλλάξεις

Abstract

Although the proximate cause of functional hypothalamic amenorrhoea (FHA) is the abnormal gonadotropic-releasing hormone (GnRH) secretion, it is seemingly more than an isolated desynchronisation of the GnRH axis. There is fair evidence to support the association of FHA with behavioural, emotional, cognitive and psychological factors. Previous studies underscored the psychological FHA correlates; notwithstanding, the pivotal role of sleep disorders (SleD) has not been elucidated thus far. Moreover, it remains uncertain, whether this variability is also attributable to a genetic predisposition. The Prokineticin 2 (PROK2) and Prokineticin receptor 2 (PROKR2) singling pathway is implicated in the cause of idiopathic hypogonadotropic hypogonadism (IHH). Two heterozygous PROKR2 mutations (g. 254 G>A and g. 518 T>G) have also been identified amongst patients with FHA. The latter were found to be loss-of-function mutations. We hypothesised that FHA women suffer from SleD. We aimed to ascertain the anxiety levels (AL) role on FHA pathophysiology and to identify plausible associations with other known FHA predisposing factors. We also aimed to identify any possible mutations in PROKR2 gene in subjects with FHA. We conducted a prospective case-control study spanning the period January 2016 to Οctober 2019. We recruited forty-one FHA women and 86 healthy controls. We assessed SleD and other FHA predisposing factors via self-reported questionnaires. The Spearman’s correlation coefficient (rho) was used to examine possible correlations among the different variables. Multivariate logistic regression analysis was conducted to identify independent factors. We also analysed the coding sequence of PROKR2 in 84 women: 41 with FHA, 23 with IHH, and 20 healthy controls respectively. Genomic DNA was extracted from peripheral blood samples using PureLink Genomic DNA Kits for purification of genomic DNA. PCR was performed using primers designed to amplify the two coding exons and the exon-intron boundaries. The amplified PCR products were sequenced using the ΑΒΙ Prism 3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems. Variants were validated using the sequencing Analysis v 5.2 software.Women with FHA reported having higher SleD (p=0.004). There was a significant positive correlation between SleD and AL (rho=0.879, p<0.0001). Significant correlation was also found between AL and several AIS-8 constituents, including sleep induction (rho=0.529, p=0.0004), awakenings during the night (rho=0.603, p<0.0001), final awakening (rho=0.421, p=0.0061), total sleep duration (rho=0.638, p<0.0001), quality of sleep (rho=0.629, p<0.0001), well-being during the day (rho=0.34, p=0.029) and sleepiness during the day (rho=0.51, p=0.007). High AL were correlated with 2.83-fold increased SleD risk (p=0.04). Mean scores on Eating Attitudes Test-26 (EAT-26) were significantly higher in females with FHA (p<0.0001). Women with FHA were characterised by significantly higher scores at the sub-scale items of dieting (p=0.03) and bulimia & food preoccupation (p<0.001) compared to healthy controls. Significant difference was also observed between the mean scores of the two groups in all other questionnaires: State-Trait-Anxiety-Inventory (STAI) (p<0.0001), Multidimensional Body-Self-Relations Questionnaire (MBSRQ) (p<0.0001) and International Physical Activity Questionnaire (IPAQ) (p=0.004). EAT-26 scores were positively correlated with scores on STAI (rho=0.26, p=0.04), MBSRQ (rho=0.79, p<0.0001) and IPAQ (rho= 0.35, p=0.03). High scores on IPAQ and STAI were correlated with a 12.2-fold (p=0.008) and 4.3-fold (p=0.04) increased risk for high scores on EAT-26, respectively. Eight novel PROKR2 mutations were identified in five of the 41 women with FHA, either in heterozygous state (two cases) or in homozygous or compound heterozygous state (three cases) : g. 241 G>C, g. 296 G>T, g. 375 A>G, g. 404 A>G, g. 404 C>G, g. 410 C>A, g. 421 G>A, and g. 475 G>T. Furthermore, three PROKR2 heterozygous mutations were identified in three of 23 women with IHH: g. 246 C>T, g. 252 C>T and g. 259 G>C. No mutations were found in the cohort of 20 controls with normal menstrual cycles. Disordered eating behaviours (DEBs) may occur in FHA populations at a higher frequency compared to the general population. Anxiety and overweight preoccupation may underlie and independently contribute to development and maintenance of both DEBs and FHA. Furthermore, FHA women are seemingly more prone to SleD and those with SleD suffer from higher AL. In view of this evidence, the potential rationale of adding psychological and SleD evaluation to their clinical care is highlighted. Finally, novel mutations in PROKR2 gene were found in women with FHA, suggesting that these variants may contribute to an extent to the variable vulnerability of women to functional changes in GnRH secretion. Identification of gene mutations underlying FHA may lead to new pathophysiology insights, improved diagnostics, and novel treatment approaches. Further research to ascertain the functional impact of these variants is warranted. Differences in the genetic backgrounds of various ethnic populations should also be considered.

Η παθοφυσιολογία της λειτουργικής υποθαλαμικής αμηνόρροιας (ΛΥΑ) είναι πολύπλοκη και δεν χαρακτηρίζεται απλά ως μια μεμονωμένη απορρύθμιση της κατά ώσεις έκκρισης της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών (GnRH). Έχει συσχετιστεί με συναισθηματικούς, συμπεριφορολογικούς και ψυχοσωματικούς παράγοντες που μεμονωμένα ή συνεργικά οδηγούν σε απορρύθμιση του υποθαλάμου. Προηγούμενες μελέτες υπογράμμισαν τον ρόλο των ψυχοσωματικών παραγόντων στην παθογένεση της ΛΥΑ, ωστόσο ο κομβικός ρόλος των διαταραχών του ύπνου σε αυτούς τους πληθυσμούς δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί. Eπιπροσθέτως, παραμένει ασαφές το πιθανό γενετικό υπόβαθρο της νόσου. Είναι γνωστή η συσχέτιση των μεταλλάξεων της προκινετισίνης 2 (PROK2) και του υποδοχέα της (PROR2) με την παθογένεση του ιδιοπαθούς υπογοναδοτροπικού υπογοναδισμού (ΙYY). Δύο απενεργοποιητικές μεταλλάξεις (loss-of-function mutations) (g. 254 G>A and g. 518 T>G) του γονιδίου του PROKR2 έχουν αναφερθεί σε γυναίκες με ΛΥΑ. Δεδομένου οτι οι αγχώδεις διαταραχές και οι διαταραχές του ύπνου συχνά συνυπάρχουν, υποθέσαμε ότι η επίπτωση των διαταραχών του ύπνου θα είναι αυξημένη σε ασθενείς με ΛΥΑ. Στόχος της παρούσας έρευνας, ήταν η μελέτη των διαταραχών του ύπνου σε Ελληνίδες έφηβες και νέες γυναίκες με ΛΥΑ και της πιθανής αλληλοσυσχέτισης τους με γνωστούς ψυχοσωματικούς προδιαθεσικούς παράγοντες. Επίσης, η παρούσα μελέτη ανέλυσε τον ρόλο του γονιδίου του υποδοχέα της προκινετισίνης-2 (PROKR2) στην παθογένεση της ΛΥΑ. Η παρούσα μελέτη διεξήχθη απο το Νοέμβριο του 2015 μέχρι τον Οκτώβριο του 2019. Κατά την ανωτέρω χρονική περίοδο, 56 έφηβες και νέες γυναίκες ηλικίας μεταξύ 15 και 22 ετών με επιβεβαιωμένη ΛΥΑ προσήλθαν στο ιατρείο Παιδικής και Εφηβικής Γυναικολογίας του Γ.Ν.Α. Αλεξάνδρα, 41 εκ των οποίων δέχθηκαν να ενταχθούν στο πρωτόκολλο. Επιπροσθέτως, 12 ασθενείς με ΙΥΥ, 1 ασθενής με σύνδρομο Κallman και 86 περιπτώσεις υγιών μαρτύρων συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη. H αξιολόγηση των ψυχοσωματικών παραγόντων έγινε μέσω αυτοσυμπληρούμενων ερωτηματολογίων. Στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις αποτιμήθηκαν μετά τον προσδιορισμό του συντελεστή συσχέτισης rho του Spearman. Τέλος, για την πολυπαραγοντική ανάλυση των διαφόρων διαταραχών χρησιμοποιήθηκε η λογαριθμική παλινδρόμηση. Επίσης, αναλύσαμε τις κωδικοποιούσες αλληλουχίες των δύο εξονίων του PROKR2, καθώς επίσης και τις εγγείς περιοχές μεταξύ των εξονίων και των ενδονίων σε 41 γυναίκες με ΛΥΑ, 23 γυναίκες με ΙΥΥ και 20 υγιείς μάρτυρες αντιστοίχως. Εικοσιπέντε από τις 41 (61%) ασθενείς με ΛΥΑ και 21 από τις 86 (24.4%) γυναίκες της ομάδας ελέγχου βρέθηκαν να εμφανίζουν διαταραχές του ύπνου. Στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε στις τιμές του ερωτηματολογίου της κλίμακας αϋπνίας Αθηνών (Athens Insomnia Scale, AIS-8) (p=0.004) ανάμεσα στις δύο ομάδες. Στατιστικά σημαντική θετική γραμμική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του σκορ του ερωτηματολογίου AIS-8 και των υψηλών επιπέδων άγχους (rho=0.79, p<0.0001). Στατιστικά σημαντική θετική γραμμική συσχέτιση βρέθηκε επίσης μεταξύ των υψηλών επιπέδων άγχους και των υποκλιμάκων της έλευσης του ύπνου (rho=0.53, p=0.0004), της αφύπνισης (rho=0.6, p<0.0001), της συνολικής διάρκειας του ύπνου (rho=0.64, p<0.0001), της ποιότητας του ύπνου (rho=0.63, p<0.0001), της διάθεσης κατά τη διάρκεια της ημέρας (rho=0.34, p=0.03) και της ημερήσιας υπνηλίας (rho=0.51, p=0.007) αντίστοιχα. Τέλος, η πολλαπλή λογιστική παλινδρόμηση έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα άγχους σχετίζονταν με 2.83 φορές υψηλότερη πιθανότητα για την ανάπτυξη διαταραχών του ύπνου (p=0.04). Είκοσι από τις 41 (48.8%) ασθενείς με ΛΥΑ και 10 από τις 86 (11.6%) γυναίκες της ομάδας ελέγχου βρέθηκαν να εμφανίζουν διαταραγμένη διατροφική συμπεριφορά. Στατιστικά σημαντική διαφορά βρέθηκε στις τιμές του ερωτηματολογίου διαιτητικών συνηθειών (ΕΑΤ-26) (p<0.0001) ανάμεσα στις δύο ομάδες, καθώς επίσης και στις υποκλίμακες της δίαιτας (p=0.03) και της βουλημίας (p<0.001). Στατιστικά σημαντική αρνητική γραμμική συσχέτιση βρέθηκε μεταξύ του σκορ του ερωτηματολογίου ΕΑΤ-26 και του δείκτη μάζας σώματος (rho=-0.36, p=0.02), ενώ επίσης βρέθηκε στατιστικά σημαντική θετική γραμμική συσχέτιση μεταξύ του σκόρ του ερωτηματολογίου ΕΑΤ-26 και του άγχους (rho=0.26, p=0.04), της εικόνας σώματος (rho=0.79, p<0.0001) και της φυσικής δραστηριότητας (rho=0.35, p=0.03) αντίστοιχα. Η διενέργεια πολλαπλής λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε ότι η ανησυχία για την εικόνα σώματος σχετιζόταν με 12.2 φορές υψηλότερη πιθανότητα ανάπτυξης δυσλειτουργικών διατροφικών διαταραχών (p=0.0008), ενώ τα υψηλά επίπεδα άγχους με 4.3 φορές υψηλότερη πιθανότητα (p=0.04) αντίστοιχα.Οκτώ νέες μεταλλάξεις του γονιδίου PROKR2 βρέθηκαν σε πέντε απο τις 41 γυναίκες με ΛΥΑ: g. 241 G>C, g. 296 G>T, g. 375 A>G, g. 404 A>G, g. 404 C>G, g. 410 C>A, g. 421 G>A, and g. 475 G>T. Επίσης, τρεις νέες μεταλλάξεις βρέθηκαν σε τρεις απο τις 23 γυναίκες με ΙΥΥ: g. 246 C>T, g. 252 C>T and g. 259 G>C. Δεν ανευρέθησαν μεταλλάξεις στην κοόρτη των υγιών μαρτύρων. Συμπερασματικά, η μελέτη αυτή έδειξε ότι οι γυναίκες με ΛΥΑ παρουσιάζουν σε μεγαλύτερη επίπτωση διαιτητικών διαταραχών σε σχέση με τον γενικό πληθυσμό. Οι αγχώδεις διαταραχές και έντονη ανησυχία για την εικόνα σώματος συχνά συνυπάρχουν και συμβάλλουν στην παθογένεση και συντήρηση τόσο της ΛΥΑ όσο και των διαιτητικών διαταραχών. Επίσης, οι γυναίκες με ΛΥΑ φαίνεται να είναι περισσότερο ευπαθείς στις διαταραχές του ύπνου, ενώ εκείνες με τέτοιες διαταραχές παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα άγχους. Τέλος, κατόπιν μοριακής ανάλυσης του γονιδίου PROKR2 ανιχνεύτηκαν νέες μεταλλάξεις, οι οποίες ενδέχεται να σχετίζονται με την ευαισθησία των γυναικών με υποθαλαμική αμηνόρροια στις λειτουργικές διαταραχές της έκκρισης της GnRH. H ανίχνευση τέτοιων μεταλλάξεων σε ασθενείς με ΛΥΑ ενδέχεται να ανοίξει νέους ορίζοντες σχετικά με την παθοφυσιολογία και διάγωση της διαταραχής, καθώς επίσης να οδηγήσει σε καινοτόμες θεραπευτικές προσεγγίσεις.