Μελέτη μηχανισμών καρδιοπαθειών χρησιμοποιώντας το Zebrafish ως πειραματικό μοντέλο

Abstract

Cardiovascular diseases are nowadays one of the leading causes of death in the developed world. Also very important is the contribution of angiogenesis to the development of cancerous tumors. It is therefore necessary to contribute to the basic research in order to better study the mechanisms of these diseases but also to discover new drugs related to angiogenesis. In recent years, the zebrafish animal model has played an important role in these conditions. Zebrafish (Danio rerio) is widely used as an animal model to understand the pathophysiology of cardiovascular diseases. Here, we present the adult cardiac phenotype of weak atrium, myh6-/-, which carry mutations in the zebrafish atrial myosin heavy chain. Homozygous mutants survive to adulthood and are fertile despite their initial weak atrial beat. In adult mutants, the atrium remains hypoplastic and shows elastin deposition while mutant ventricles exhibit increased size. In mammals, hypertrophy is the most common mechanism resulting in cardiomegaly. Using immunohistochemistry and confocal microscopy to measure cardiomyocyte cell size, density and proliferation, we show that the enlargement of the myh6-/- ventricle is predominantly due to hyperplasia. However, we identified similar transcriptional profiles to the mammalian hypertrophy response via RT-PCR of the hyperplastic ventricles. Furthermore, we show activation of the ER-stress pathway by western blot analysis. In conclusion, we can assume, based on our model, that molecular signaling pathways associated with hypertrophy in mammals, in combination with ER-stress activation, result in hyperplasia in zebrafish. In addition, to our knowledge, this is the first time to report elastin deposition in the atrium. In parallel, we studied small molecules that inhibit angiogenesis and are attractive drug candidates for cancer, retinopathies, and age-related macular degeneration. In vivo phenotypic screening in zebrafish (Danio rerio) emerges as a powerful methodology to identify and optimize novel compounds with pharmacological activity. Zebrafish provides several advantages for in vivo phenotypic screens especially for angiogenesis, since it develops rapidly, externally, and does not rely on a functional cardiovascular system to survive for several days during development. In this study, we utilize a transgenic line that allows the noninvasive monitoring of angiogenesis at a cellular level. The inhibition of angiogenesis can be observed under a fluorescent stereoscope and quantified. To exemplify the versatility and robustness of the zebrafish screen, we have employed a series of 60 novel compounds that were designed based on a potent VEGFR2 inhibitor. Herein, we report their structure-based design, synthesis, and in vivo zebrafish screening for optimal activity, toxicity, and off-target effects, which revealed six reversible inhibitors of angiogenesis. Finally, in the present doctoral dissertation, genes were attempted to play a role in the morphogenesis of the heart valves and to demonstrate their relationship through targeted mutagenesis with the help of the CRISPR-Cas system and to create a transgenic zebrafish to respond to shear stress. In conclusion, the present thesis shows the great potential of zebrafish for the reconstruction / remodeling of the heart in pathological conditions and proves its ability to be used as an ideal model for the study of cardiovascular diseases.

Οι καρδιαγγειακές παθήσεις αποτελούν στην εποχή μας μία από τις πρώτες αιτίες θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Επίσης, πολύ σημαντική είναι η συμβολή της αγγειογένεσης στην ανάπτυξη των καρκινικών όγκων. Καθίσταται λοιπόν αναγκαία η συμβολή της βασικής έρευνας ώστε να μελετηθούν καλύτερα οι μηχανισμοί των παθήσεων αυτών αλλά και να ανακαλυφθούν νέα φάρμακα που σχετίζονται με την αγγειογένεση. Τα τελευταία χρόνια σημαντικό ρόλο παίζει προς αυτές τις κατευθύνσεις το ζωϊκό πρότυπο μοντέλο zebrafish. Το zebrafish (Danio rerio) χρησιμοποιείται ευρέως ως ζωικό μοντέλο για την κατανόηση της παθοφυσιολογίας των καρδιαγγειακών παθήσεων. Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο καρδιακός φαινότυπος υποτροφικού κόλπου, myh6-/-, σε ενήλικα ψάρια, τα οποία φέρουν μετάλλαξη στη βαριά αλυσίδα κολπικής μυοσίνης του zebrafish. Οι ομόζυγοι φορείς επιβιώνουν μέχρι την ενηλικίωση και είναι γόνιμοι. Στα ενήλικα μεταλλαγμένα ψάρια, ο κόλπος παραμένει υποπλαστικός και εμφανίζει εναπόθεση ελαστίνης, ενώ οι κοιλίες παρουσιάζουν αυξημένο μέγεθος. Στα θηλαστικά, η υπερτροφία είναι ο συνηθέστερος μηχανισμός που οδηγεί σε καρδιομεγαλία. Χρησιμοποιώντας την ανοσοϊστοχημεία και συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης για να μετρήσουμε το μέγεθος, την πυκνότητα και τον πολλαπλασιασμό των καρδιομυοκυττάρων, αποδεικνύεται ότι η μεγέθυνση της κοιλίας myh6-/- οφείλεται κατά κύριο λόγο στην υπερπλασία. Εντούτοις, εντοπίσαμε παρόμοια μεταγραφικά προφίλ στην απόκριση υπερτροφίας θηλαστικών μέσω RT-PCR των υπερπλαστικών κοιλιών. Περαιτέρω, δείχνουμε την ενεργοποίηση της οδού του στρες-ΕΔ με ανάλυση ανοσοαποτυπώματος κατά Western. Συμπερασματικά, μπορούμε να υποθέσουμε, με βάση το μοντέλο μας, ότι μονοπάτια μοριακής σηματοδότησης που συνδέονται με την υπερτροφία στα θηλαστικά, σε συνδυασμό με την ενεργοποίηση του στρες-ΕΔ, καταλήγουν σε υπερπλασία στο zebrafish. Επιπλέον, αυτή είναι η πρώτη φορά που αναφέρθηκε η εναπόθεση ελαστίνης στον κόλπο. Παράλληλα, μελετήθηκαν μικρά μόρια που αναστέλλουν την αγγειογένεση και είναι ελπιδοφόρα υποψήφια φάρμακα για τον καρκίνο, τις αμφιβληστροειδοπάθειες και τον εκφυλισμό της ωχράς κηλίδας που σχετίζεται με την ηλικία. Η in vivo φαινοτυπική διαλογή σε zebrafish (Danio rerio) αναδεικνύεται ως μια ισχυρή μεθοδολογία για την ταυτοποίηση και βελτιστοποίηση νέων ενώσεων με φαρμακολογική δράση. Το zebrafish παρέχει αρκετά πλεονεκτήματα για τις in vivo φαινοτυπικές παρατηρήσεις ειδικά για την αγγειογένεση, καθώς αναπτύσσεται ταχέως και δεν βασίζεται σε λειτουργικό καρδιαγγειακό σύστημα για να επιβιώσει για αρκετές ημέρες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιούμε μια διαγονιδιακή σειρά που επιτρέπει τη μη επεμβατική παρακολούθηση της αγγειογένεσης σε κυτταρικό επίπεδο. Η αναστολή της αγγειογένεσης μπορεί να παρατηρηθεί κάτω από ένα στερεοσκόπιο φθορισμού και να ποσοτικοποιηθεί. Εκμεταλλευόμενοι τις δυνάτοτητες του zebrafish, χρησιμοποιήσαμε μια σειρά από 60 καινοτόμες ενώσεις που σχεδιάστηκαν με βάση την αναστολή του υποδοχέα VEGFR2. Στα πειράματα αυτά μπορεί να να υπολογιστεί η συγκέντρωση στην οποία προκαλείται τοξικότητα και να καταδειχθούν πιθανές παρενέργειες των υπό εξέταση ουσιών. Με αυτόν τον τρόπο αποκαλύφθηκαν 6 αντιστρεπτοί αναστολείς της αγγειογένεσης. Τέλος, στα πλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής επιχειρήθηκε να ανιχνευθούν γονίδια τα οποία παίζουν ρόλο στη μορφογένεση των καρδιακών βαλβίδων και να αποδειχθεί η σχέση τους μέσω στοχευμένης μεταλλαξιγένεσης με τη βοήθεια του συστήματος CRISPR-Cas και να δημιουργηθεί μια διαγονιδιακή σειρά zebrafish που να αποκρίνεται στις αλλαγές της διατμητικής τάσης. Συμπερασματικά, από την παρούσα διατριβή προκύπτει η μεγάλη δυνατότητα του zebrafish για ανασύσταση/αναδιαμόρφωση της καρδιάς του σε παθολογικές καταστάσεις και αποδεικνύεται η ικανότητά του να χρησιμοποιείται ως ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη των καρδιαγγειακών παθήσεων.