Μελέτη της οξείας μυελογενούς λευχαιμίας και των ΜΔΣ συνδρόμων με κυτταρομετρία ροής και μοριακές τεχνικές

Abstract

Objective: Immunophenotype has been correlated with molecular aberrations in several studies. The aim of this study was the discovery of immunophenotypic features related to mutations in AML and MDS patients connected to prognostic factors. Moreover, an effort to evaluate a method for the detection of the most common NPM1 mutations of exon12 and Internal Tandem Duplications (ITD) mutations of FLT3 gene by flow cytometry was performed. Method: Patients with de novo myeloid neoplasms [ AML and MDS (AML-M3 patients were excluded)] were included. FLT3/ITD/TKD and NPM1 mutations were detected by PCR and fragment analysis. The immunophenotypic analysis was performed by multi-dimensional flow cytometry (FC) with a standardized panel of monoclonal antibodies on peripheral blood or bone marrow samples. Nucleophosmin Antibody and CD135 were used for the mutations immunophenotypic detection. Results: NPM1 and/or FLT3 mutations correlated with low or no expression of more immature cells markers such as CD34, CD117, HLADR, as well as higher expression of more mature markers such as CD11b. The higher expression of CD33 should be mentioned as well. The presence of NPM1mut and FLT3/ITD does not seem to be detectable by FC at least using these two monoclonal antibodies. The presence of CD7 aberrant lymphoid marker’s expression was associated with FLT3mut, NPM1wt genotype. CD56 or CD2 positivity was found only in patients’ samples negative for NPM1 and/or FLT3 mutations. Conclusions: Certain immunophenotype findings including the presence of aberrant lymphoid markers may be indicative of the presence of mutations in NPM1 and FLT3 linked to prognosis.

Η διάγνωση της ΟΜΛ και των ΜΔΣ βασίζεται στον συνδυασμό των μορφολογικών, ανοσοφαινοτυπικών, κυτταρογενετικών και μοριακών ευρημάτων. Σε αρκετές μελέτες, ο ανοσοφαινότυπος έχει συσχετιστεί τόσο με τη μοριακή εκτροπή όσο και με την πρόγνωση, ωστόσο τα αποτελέσματα παραμένουν αμφιλεγόμενα. Επιπλέον, έχουν αναφερθεί ορισμένες προσπάθειες για τον προσδιορισμό ορισμένων μοριακών διαταραχών, μέσω ανοσοφαινοτυπικών δεικτών, αλλά με αμφιλεγόμενη επιτυχία. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η συσχέτιση των ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών και μοριακών μεταλλάξεων στους ασθενείς με ΟΜΛ και ΜΔΣ καθώς και η και σύγκριση σχετικών προγνωστικών παραγόντων. Επιπλέον, διεξήχθη μια προσπάθεια να αναπτυχτεί μια κυτταρομετρική μέθοδος διερεύνησης της έκφρασης των πρωτεϊνών των μεταλλαγμένων γονιδίων ΝΡΜ1 και FLT3 τόσο στην επιφάνεια όσο και στο κυτταρόπλασμα των αώρων κυττάρων της μυελικής σειράς. Στη μελέτη αυτή, συμπεριλήφθηκαν 94 ασθενείς με νεοδιαγνωσθέντα μυελοειδή νεοπλάσματα (ΟΜΛ-ΜΔΣ). Επισημαίνεται ότι οι ασθενείς με οξεία προμυελοκυτταρική λευχαιμία αποκλείστηκαν από την μελέτη. Οι μεταλλάξεις FLT3 και ΝΡΜ1 ανιχνεύθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και τριχοειδική ηλεκτροφόρηση. Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση διεξήχθη με πολυπαραμετρική κυτταρομετρία ροής με καθορισμένο πάνελ μονοκλωνικών αντισωμάτων, σε δείγματα περιφερικού αίματος ή μυελού των οστών. Το αντίσωμα νουκλεοφωσμίνης (NPM1) και FLT3 (CD135) χρησιμοποιήθηκαν για τις ανοσοφαινοτυπική ανιχνεύση των μεταλλάξεων. Από τη μελέτη αυτή, βρέθηκε ότι ασθενείς με χαμηλή έκφραση ή χωρίς έκφραση αώρων κυτταρικών δεικτών, όπως τα CD34, CD117, HLADR, και υψηλή έκφραση πιο ώριμων δεικτών, όπως το CD11b, βρέθηκαν θετικοί για την μετάλλαξη NPM1. Σε ασθενείς με χαμηλή η καθόλου έκφραση των CD34, CD117, HLADR βρέθηκαν, επιπλέον, μεταλλάξεις του FLT3. Η υψηλή έκφραση του CD11b έχει συσχετιστεί με κακή πρόγνωση σε ομάδα ασθενών χωρίς κυτταρογενετικές και μοριακές διαταραχές και ο συνδυασμός των τριών μεταλλάξεων συσχετίζεται, επίσης, με κακή πρόγνωση. Η παρουσία της έκτοπης έκφρασης του CD7 βρέθηκε σε ασθενείς με FLT3 αλλά όχι NPM1 μετάλλαξη. Οι ασθενείς με μυελοδυσπλασικό σύνδρομο είχαν σημαντικά υψηλότερο CD34 MFI, σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των διπλά θετικών CD34/117 καθώς και σημαντικά υψηλότερη τιμή στα CD13, σε σύγκριση με τους ασθενείς με οξεία μυελογενή λευχαιμία. Συμπερασματικά, η κυτταρομετρική ανίχνευση κοινών φαινοτυπικών δεικτών στην ΟΜΛ και στα ΜΔΣ προσφέρει ενδείξεις σχετικά με την παρουσία NPM1 και FLT3 μεταλλάξεων, που συνδέονται με την πρόγνωση .Επίσης η θετικότητα κάποιων έκτοπων λεμφικών δεικτών φαίνεται να συσχετίζεται με την παρουσία ή την απουσία αυτών των μεταλλάξεων.