Ανάπτυξη και εφαρμογή ταυτόχρονης ατομικής φασματοσκοπίας εκπομπής πλάσματος λέιζερ και μοριακής φασματομετρίας μάζας υπερηχητικού ιοντισμού (LIBS-SSI-MS) στη μελέτη βιομορίων και συμπλόκων

Abstract

In the context of this thesis we have developed a new hybrid technique (LIBS/SSI-MS) that combines Sonic-Spray Ionization Mass Spectrometry (SSI-MS) with Laser-Induced Breakdown Spectroscopy. The new analytical technique will be able to provide simultaneously in real time information on both elemental composition and molecular weight of the target compounds solutions.The combination of the two techniques is achieved by means of a pneumatic nebulizer, whose role is to produce an aerosol spray from the liquid solution. Charged droplets from the aerosol are produced, due to Sonic-Spray ionization, leading to the formation of charged molecules in the gas phase, which are detected by the mass spectrometer. In parallel, by focusing laser pulses in the aerosol giving rise to the formation of strongly emitting plasma, of which time-resolved LIBS spectra are recorded and thus elemental composition is determined. In order to validate the accuracy, the applicability and the potential of the LIBS/SSI-MS we have studied several standard solutions containing Ca(II) and Ba(II) ions complexed with EDTA, metalloprotein solutions, containing alpha-lactalbumin and superoxide dismutase, and a Cu6-Er co-ordination compound ([Cu6(II)Er(III)(aib)6(OH)3(OAc)3(NO3)3], Mr = 1574 amu). In the case of metalloprotein analysis the proposed LIBS/SSI-MS technique enables the determination of the metallic ion concentration in the protein solution, thus extracting the concentration ratio [Metal]:[Protein], which represents the stoichiometry of the metal ions in the protein solution, and can be related with the proteins biological activity. In parallel, we have studied the time evolution of the plasma formed in the aerosol, by means of time-resolved imaging spectroscopy, aiming to understand the mechanism that govern plasma formation and its interaction with the aerosol droplets. More specifically we have collected plasma images at distinct time scales after formation, and images from the aerosol droplets generated by the pneumatic nebulizer. The results showed that the nebulizer is sputtering droplets, a behavior that results in a continuously changing number of droplets within the plasma formation volume. Under typical irradiation conditions (ΕPulse > 160 mJ), plasma formation is firstly observed in the air-argon interface. The aerosol droplets within the plasma formation region are gradually evaporated and diffused to the plasma volume (V ≈ 20 mm3). The atomization and diffusion of the droplets are finished about 10 μs after plasma formation. At last, we have studied the potential to use ultraviolet (λ=248 nm) femtosecond (τ = 450 fs) laser pulses for plasma formation in the aerosol. The sensitivity of the fs-LIBS approach is about one order of magnitude lower than the coventional ns-LIBS methodology, a fact that is attributed to the significantly lower energy (Ε ≈ 15 mJ) that is used for plasma formation and due to the lack of interaction between the plasma and the femtosecond laser pulses.

Στο πλαίσιο της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη μιας νέας υβριδικής αναλυτικής μεθόδου (LIBS/SSI-MS), η οποία συνδυάζει τη μοριακή φασματομετρία μάζας υπερηχητικού ιοντισμού (SSI-MS) με τη φασματοσκοπία εκπομπής πλάσματος επαγόμενου από λέιζερ (LIBS). Η μέθοδος προσφέρει τη δυνατότητα χαρακτηρισμού διαλυμάτων παρέχοντας πληροφορίες σε πραγματικό χρόνο σχετικά με τη στοιχειακή σύσταση, καθώς και τη μοριακή μάζα των ενώσεων που περιέχουν. Ο συνδυασμός των δύο τεχνικών βασίζεται στη χρήση πνευματικού εκνεφωτή, ο οποίος μετατρέπει το προς ανάλυση διάλυμα σε αερόλυμα. Τα σταγονίδια στο αερόλυμα παράγονται επιφανειακώς φορτισμένα, εξαιτίας φαινομένων υπερηχητικού ιοντισμού, με αποτέλεσμα τη δημιουργία μοριακών ιόντων του αναλύτη στην αέρια φάση, τα οποία ανιχνεύονται από το φασματόμετρο μάζας. Παράλληλα, με την εστίαση παλμών λέιζερ στο εκνέφωμα, τμήμα του αερολύματος μετατρέπεται σε πλάσμα και μέσω του φάσματος εκπομπής αυτού καθίσταται εφικτός ο προσδιορισμός της στοιχειακής σύστασης του δείγματος. Για την αξιολόγηση της ακρίβειας και της δυναμικής της τεχνικής LIBS/SSI-MS χαρακτηρίστηκαν πρότυπα διαλύματα υδατικά και μη, των συμπλόκων ασβεστίου και βαρίου με το EDTA, δύο μεταλλοπρωτεϊνών, πιο συγκεκριμένα της σουπεροξειδικής δισμουτάσης και της α-λακταλβουμίνης, καθώς και μίας ένωσης συναρμογής ([Cu6(II)Er(III)(aib)6(OH)3(OAc)3(NO3)3], ΜΒ = 1574 amu), η οποία περιέχει μεταλλικά ιόντα χαλκού και ερβίου. Στην περίπτωση των μεταλλοπρωτεϊνών η εφαρμογή της τεχνικής LIBS-SSI-MS επιτρέπει τον προσδιορισμό του λόγου των συγκεντρώσεων των μεταλλικών ιόντων προς τη συγκέντρωση της πρωτεΐνης ([Μ]:[Πρωτεΐνη]), τιμή η οποία αντανακλά τη στοιχειομετρία του μεταλλοϊόντος στην πρωτεΐνη και συνδέεται άμεσα με την ενεργότητα αυτής και κατ’ επέκταση με τη βιολογική της δραστικότητα. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε χρονοαναλυόμενη απεικονιστική μελέτη του πλάσματος που σχηματίζεται στο αερόλυμα, με στόχο την κατανόηση των διεργασιών δημιουργίας του πλάσματος και την εξέλιξη αυτού στο χρόνο. Ειδικότερα πραγματοποιήθηκε καταγραφή εικόνων του πλάσματος σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά το σχηματισμό του, καθώς και την καταγραφή εικόνων του αερολύματος που δημιουργείται από τον πνευματικό εκνεφωτή. Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι ο ψεκασμός από τον εκνεφωτή είναι ασυνεχής με αποτέλεσμα να υπάρχει μεταβαλλόμενος αριθμός σταγονιδίων στην περιοχή εστίασης της ακτινοβολίας λέιζερ. Σε τυπικές συνθήκες ακτινοβόλησης (Ε > 160 mJ) o σχηματισμός του πλάσματος λαμβάνει χώρα πρωτογενώς στον αέρα, ενώ παρατηρείται ότι τα σταγονίδια σταδιακά ατομοποιούνται και διαχέονται εντός του όγκου που καταλαμβάνει το πλάσμα (V ≈ 20 mm3 ) για χρονική περίοδο της τάξης των 10 μs από την έναρξη της δημιουργίας του πλάσματος. Επίσης διερευνήθηκε η προοπτική χρήσης υπερβραχέων παλμών λέιζερ (τ = 450 fs) στο υπεριώδες (λ = 248 nm) για το σχηματισμό του πλάσματος στο αερόλυμα. Η ευαισθησία της προσέγγισης είναι χαμηλότερη κατά μία τάξη μεγέθους σε σχέση με την τυπική μεθοδολογία ns-LIBS, γεγονός το οποίο αποδίδεται στη σημαντικά χαμηλότερη ενέργεια (Ε ≈ 15 mJ) που προσφέρεται για το σχηματισμό πλάσματος και την απουσία αλληλεπίδρασης των υπερβραχέων παλμών με το πλάσμα.