Μελέτη του ρόλου των παραγόντων πήξης Xa και θρομβίνης στην αθηροθρόμβωση

Abstract

Endothelial cells play a crucial role in atherosclerosis. Endothelial dysfunction contributes to the first stages of plaque formation through the recruitment of leukocytes to the endothelium. The rupture of the atherosclerotic plaque leads to platelet activation and thrombosis. Endothelial progenitor cells (EPCs) are pluripotent cells that differentiate into mature endothelial cells, contributing to endothelial regeneration. It has been proved that circulating CD34+ cells differentiate into EPCs after their interaction with platelets and that this interaction leads to further maturation into endothelial cells. Coagulation factors Xa (FXa) and thrombin, apart from their haemostatic role, exhibit also non-haemostatic cellular effects that are mediated through protease-activated receptors (PARs), which are found on various cell types, such as platelets and endothelial cells. The aim of the present study was to investigate the role of FXa and thrombin in platelet activation and aggregation, as well as their role in EPC activation. For this purpose, the role of these factors in platelet activation and aggregation, as well as the effect of the direct oral anticoagulants rivaroxaban and dabigatran, which target FXa and thrombin respectively, was studied using PRP, washed platelets and whole blood. Additionally, the role of PAR-1 in FXa- or thrombin-induced platelet activation and aggregation was studied using the selective PAR-1 antagonist, vorapaxar. Platelet activation and aggregation were evaluated using light transmittance aggregometry, impendance aggregometry and flow cytometry. Moreover, the role of PAR-1 in the differentiation of CD34+ cells into EPCs, as well as on the formation of CD34+ cells/platelets conjugates, were aso studied using flow cytometry. Consequently, the role of FXa and thrombin in late-outgrowth endothelial cell activation (OECs) was investigated using the membrane expression of the adhesion molecule ICAM-1, as well as the expression of MCP-1, as activation markers. The role of rivaroxaban and dabigatran, as well as the role of PAR-1 on OEC activation by FXa and thrombin, were also evaluated. The present study proved that FXa and thrombin are potent platelet agonists and that FXa exhibits a delayed aggregatory effect. Platelet activation by these factors is mediated mainly via PAR-1. Furthermore, rivaroxaban and dabigatran inhibit FXa- and thrombin-induced platelet aggregation in a dose-dependent manner, without showing selectivity over one factor. PAR-1 also mediates the differentiation of CD34+ cells into EPCs, as well as the formation of CD34+ cells/platelets conjugates. The present study also proved that FXa and thrombin induce the expression of ICAM-1 and MCP-1 from OECs, mainly though PAR-1 activation. Vorapaxar does not fully inhibit thrombin-induced ICAM-1 expression and MCP-1 secretion from OECs, whereas it fully inhibits the above expression from HUVECs, a result that suggests the contribution of PAR-4 in this expression from OECs. Rivaroxaban and dabigatran inhibit in a dose-dependent manner FXa- and thrombin-induced ICAM-1 expression and MCP-1 secretion, respectively. An interesting finding that was observed for the first time was the enhancement of the thrombin-induced ICAM-1 expression and MCP-1 secretion by rivaroxaban. This enchancement effect was inhibited by vorapaxar, showing the participation of PAR-1 in this action. In conclusion, platelet and endothelial cell activation by FXa and thrombin could contribute in atherothrombosis. In addition, their action on OECs could be beneficial on endothelial regeneration. Even though in the present study various cellular effects of FXa and thrombin were investigated, more studies are required in order to fully decipher their role, as well as the contribution of their respective drugs, in atherothrombosis, endothelial regeneration and angiogenesis.

Τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα αιμοπετάλια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην αθηροθρόμβωση. Η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία συμβάλλει στα πρώτα στάδια της αθηρωμάτωσης, διαμέσου της στρατολόγησης των λευκοκυττάρων στο ενδοθήλιο. Η ρήξη της αθηρωματικής πλάκας οδηγεί στην ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και τη θρόμβωση. Τα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα (endothelial progenitor cells, EPCs) αποτελούν πολυδύναμα κύτταρα τα οποία διαφοροποιούνται σε ώριμα, συμμετέχοντας στην αναγέννηση του ενδοθηλίου. Είναι αποδεδειγμένο ότι τα κυκλοφορούντα CD34+ κύτταρα μετά από την αλληλεπίδρασή τους με τα αιμοπετάλια διαφοροποιούνται σε EPCs, ενώ η παραπάνω αλληλεπίδραση οδηγεί στην περαιτέρω ωρίμανση τους σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα. Οι παράγοντες πήξης Xa (factor Xa, FXa) και θρομβίνη, εκτός του αιμοστατικού τους ρόλου, εμφανίζουν μη αιμοστατικές κυτταρικές δράσεις που διαμεσολαβούνται από τους υποδοχείς που ενεργοποιούνται από πρωτεάσες (protease-activated receptors, PARs) και εντοπίζονται σε πληθώρα κυτταρικών τύπων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοπεταλίων και των ενδοθηλιακών κυττάρων. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της δράσης των FXa και θρομβίνης στην ενεργοποίηση και συσσώρευση των αιμοπεταλίων, καθώς και την ενεργοποίηση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων. Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, μελετήθηκε η επίδραση των παραγόντων αυτών στην αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση σε PRP, πλυμένα αιμοπετάλια ή ολικό αίμα, καθώς και ο ρόλος των άμεσων από του στόματος αναστολέων του FXa και της θρομβίνης, rivaroxaban και dabigatran, αντίστοιχα. Ακόμη, μελετήθηκε ο ρόλος του υποδοχέα PAR-1 στην επαγόμενη από τον FXa ή τη θρομβίνη αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση, με τη χρήση του εκλεκτικού ανταγωνιστή του υποδοχέα, vorapaxar. Η αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση και συσσώρευση εκτιμήθηκε με τις μεθόδους της συσσωρευομετρίας οπτικής διαπερατότητας, συσσωρευομετρίας εμπέδησης και κυτταρομετρίας ροής. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε ο ρόλος του PAR-1 στη διαφοροποίηση των CD34+ κυττάρων προς EPCs, καθώς και στη δημιουργία συζευγμάτων CD34+ κυττάρων/αιμοπεταλίων, με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής. Εν συνεχεία, μελετήθηκε η δράση των FXa και θρομβίνης στην ενεργοποίηση προχωρημένης ωρίμανσης ενδοθηλιακών κυττάρων (late-outgrowth endothelial cells, OECs), χρησιμοποιώντας ως δείκτες ενεργοποίησης τη μεμβρανική έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 και την έκκριση του MCP-1. Πραγματοποιήθηκε μελέτη του ρόλου των rivaroxaban και dabigatran, καθώς και του PAR-1, στην επαγόμενη από τους δύο παράγοντες ενδοθηλιακή ενεργοποίηση. Η παρούσα μελέτη απέδειξε ότι τόσο ο FXa όσο και η θρομβίνη αποτελούν ισχυρούς αγωνιστές της αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης και συσσώρευσης, με τον FXa να έχει μία χρονικά καθυστερημένη δράση. Η δράση των δύο παραγόντων βρέθηκε να διαμεσολαβείται από τον PAR-1. Επιπρόσθετα, τα rivaroxaban και dabigatran ανέστειλαν δοσο-εξαρτώμενα την αιμοπεταλιακή συσσώρευση που προκαλείται από τον FXa και τη θρομβίνη, χωρίς να παρουσιάζεται εκλεκτικότητα ως προς το φάρμακο-στόχο. Επιπρόσθετα, ο PAR-1 βρέθηκε να διαμεσολαβεί και τη διαφοροποίηση των CD34+ κυττάρων προς EPCs, αλλά και τη δημιουργία συζευγμάτων CD34+ κυττάρων/αιμοπεταλίων. Ακόμη, η παρούσα μελέτη απέδειξε ότι ο FXa και η θρομβίνη επάγουν την έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση του MCP-1 από τα OECs, συμβάντα που διαμεσολαβούνται κυρίως από τον PAR-1. Το vorapaxar δεν ανέστειλε πλήρως την επαγόμενη από τη θρομβίνη έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση του MCP-1 από τα OECs, σε αντίθεση με τα HUVECs στα οποία η αναστολή ήταν πλήρης, αποτέλεσμα που προτείνει και τη συμμετοχή του PAR-4 στα OECs. Τα rivaroxaban και dabigatran ανέστειλαν δοσο-εξαρτώμενα την επαγόμενη από τον FXa και τη θρομβίνη, αντίστοιχα, έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση του MCP-1. Ένα ενδιαφέρον αποτέλεσμα που παρατηρήθηκε για πρώτη φορά ήταν ότι το rivaroxaban ενίσχυσε την επαγόμενη από τη θρομβίνη έκφραση του ICAM-1 και την έκκριση του MCP-1. Η ενισχυτική δράση του rivaroxaban ανεστάλη από το vorapaxar, γεγονός που υποδηλώνει τη συμμετοχή του PAR-1 στο φαινόμενο αυτό. Συμπερασματικά, η ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και των ενδοθηλιακών κυττάρων από τον FXa και τη θρομβίνη θα μπορούσε να συμβάλει στην αθηροθρόμβωση. Επιπρόσθετα, η δράση των παραγόντων αυτών στα πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα θα μπορούσε να είναι ευεργετική για την αναγέννηση του ενδοθηλίου. Παρά το γεγονός ότι η παρούσα μελέτη διερεύνησε εκτενώς ένα ευρύ φάσμα μη αιμοστατικών κυτταρικών δράσεων του FXa και της θρομβίνης, περισσότερες μελέτες απαιτούνται για να διαλευκανθεί πλήρως ο ρόλος των παραγόντων αυτών, αλλά και η συμβολή των φαρμάκων που στοχεύουν τη δράση τους στην αθηροθρόμβωση, την αναγέννηση του ενδοθηλίου και την αγγειογένεση.