Πλειοτροπικές δράσεις αγωνιστών αιμοπεταλιακών υποδοχέων: υποκείμενοι μηχανισμοί και παθοφυσιολογικός ρόλος

Abstract

Ticagrelor, a potent platelet P2Y12 receptor (P2Y12R), is unique among antiplatelet drugs because it inhibits the P2Y12R in a reversible manner as well as it demonstrates a variety of advantageous pleiotropic effects associated probably with the increased concentration of adenosine. The pleiotropic effects of ticagrelor include cardioprotection, myocardium restoration after an ischemic event, and promotion of anticoagulative factor release as well as anti-inflammatory effects. However, beyond these advantageous effects, the increased adenosine concentration is also responsible for some adverse effects of ticagrelor including dyspnea and bradycardia. Aim of the present study was to shed more light into the mechanisms underlying the pleiotropic effects of ticagrelor. We investigated whether ticagrelor, either directly through P2Y12R or indirectly through adenosine, has the ability to affect the platelet-induced the CD34+ progenitor cell differentiation into endothelial progenitor cells (EPCs) as well as the functionality of EPCs and mature endothelial cells. These data will be important components of the mechanisms which are involved in the pathophysiology of cardiovascular disease. Materials and Methods: The effect of ticagrelor, as well as the role of adenosine, was studied on the expression of the endothelial phenotype (membrane expression of KDR) by CD34+ progenitor cells as well as on the interaction of platelets with CD34+ and CD34+/KDR+ cells followed by ADP- and TRAP-6-activation using flow cytometry. We also studied the effect of platelet suspension and supernatant on the functionality of EPCs. In particular, the effect of platelet suspension was studied on the membrane expression of the adhesion molecule ICAM-1 using flow cytometry as well as on the secretion of prostacyclin (PGI2) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) using ELISA from late-outgrowth endothelial cells (OECs). The effect of platelet supernatant was also studied on the above described endothelial cell markers. Furthermore, we evaluated the effect of both ticagrelor and adenosine on the ability of EPCs to integrate into vascular structures forming capillary-like tubes and sprouts from cell spheroids. All experiments were also conducted in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Results: Ticagrelor increased the ADP- and TRAP-6-induced membrane expression of KDR on CD34+ progenitor cells, which was further amplified in the presence of the combination of ticagrelor with adenosine, an effect which was inhibited by the inverse agonist and antagonist of the A2B adenosine receptor (AR), MRS1706. Ticagrelor reduced the ADP-induced interaction of platelets with CD34+ cells in contrast to the TRAP-6-induced intercellular interaction which was not affected by ticagrelor. Ticagrelor also increased the ADP- and TRAP-6-induced interaction of platelets with CD34+/KDR+ cells, which was further amplified in the presence of adenosine. Ticagrelor increased the membrane expression of ICAM-1 in the presence of activated platelets on OECs, an effect which was also observed in the presence of resting platelets but not in the presence of ADP-activated platelets. Similar results were also observed for the secretion of PGI2 and MCP-1 from OECs. Finally, both ticagrelor and adenosine increased the capillary-like tube formation as well as the sprout formation on cell spheroids formed by OECs. Sprout formation was inhibited either in the presence of the A2AAR antagonist, SCH58621, or in the presence of the A2BAR inverse agonist and antagonist, MRS1706, while their combination inhibited totally the above described phenomenon. Similar results were also observed when HUVECs were used. Conclusion: The present study demonstrates that ticagrelor induces the differentiation of CD34+ progenitor cells into EPCs as well as their ability to integrate into vascular structures, phenomena which are probably mediated through adenosine contributing thus to endothelial regeneration and neoangiogenesis. Furthermore, the present study demonstrates that resting and not activated platelets induce the activation of EPCs. This phenomenon is also observed in the presence, even after platelet activation, suggesting that ticagrelor may promote endothelial regeneration by inhibiting platelet activation and thus allowing resting platelets to activate EPCs.

Η τικαγρελόρη, ένας ισχυρός ανταγωνιστής του αιμοπεταλιακού P2Y12 υποδοχέα (P2Y12R), παρουσιάζει μια μοναδικότητα μεταξύ των αντιαιμοπεταλιακών φαρμάκων, καθώς αναστέλλει με αντιστρεπτό τρόπο τον P2Y12R, αλλά και επειδή επιδεικνύει ένα ευρύ φάσμα πλειοτροπικών δράσεων, ο οποίες πιθανότατα σχετίζονται με την αυξημένη συγκέντρωση της αδενοσίνης. Οι πλειοτροπικές δράσεις της τικαγρελόρης περιλαμβάνουν την καρδιοπροστασία, την αποκατάσταση του μυοκαρδίου μετά από ισχαιμικό επεισόδιο, την προαγωγή απελευθέρωσης αντιπηκτικών παραγόντων και, τέλος, αντιφλεγμονώδεις δράσεις. Ωστόσο, πέραν των πλεονεκτικών αποτελεσμάτων, η αυξημένη συγκέντρωση της αδενοσίνης είναι υπεύθυνη, επίσης, για ορισμένες ανεπιθύμητες δράσεις της τικαγρελόρης, συμπεριλαμβανομένης της δύσπνοιας και της βραδυκαρδίας. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η παροχή νέων σημαντικών δεδομένων των υποκείμενων μηχανισμών σχετικά με τις πλειοτροπικές δράσεις της τικαγρελόρης. Διερευνήθηκε αν η τικαγρελόρη, είτε άμεσα διαμέσου του P2Y12R είτε έμμεσα διαμέσου της αδενοσίνης, μπορεί να επηρεάσει την επαγόμενη από τα αιμοπετάλια διαφοροποίηση των CD34+ πρόδρομων κυττάρων σε πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και τη λειτουργικότητα των πρόδρομων και ώριμων ενδοθηλιακών κυττάρων, δεδομένα τα οποία αποτελούν σημαντικά συστατικά των μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθοφυσιολογία της καρδιαγγειακής νόσου. Υλικά και Μέθοδοι: Η δράση της τικαγρελόρης, καθώς και ο ρόλος της αδενοσίνης, μελετήθηκαν στην έκφραση του ενδοθηλιακού φαινοτύπου (μεμβρανική έκφραση του υποδοχέα KDR) από τα CD34+ πρόδρομα κύτταρα, καθώς επίσης και στην αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με τα CD34+ και τα CD34+/KDR+ κύτταρα μετά από ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων με τη ADP και το TRAP-6 με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής. Στη συνέχεια, μελετήθηκε η επίδραση εναιωρήματος και υπερκειμένου αιμοπεταλίων στη λειτουργικότητα των πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων (EPCs). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδραση εναιωρήματος αιμοπεταλίων στη μεμβρανική έκφραση του μορίου προσκόλλησης ICAM-1 με τη χρήση της κυτταρομετρίας ροής, καθώς επίσης και η έκκριση της προστακυκλίνης (PGI2) και του χημειοτακτικού παράγοντα των μονοκυττάρων (MCP-1) με τη χρήση της ανοσοενζυμικής μεθόδου ELISA, από τα προχωρημένης ωρίμανσης EPCs (OECs). Η επίδραση υπερκειμένου αιμοπεταλίων μελετήθηκε επίσης στους παραπάνω δείκτες ενδοθηλιακών κυττάρων. Επιπλέον, μελετήθηκε και ο ρόλος της τικαγρελόρης στη λειτουργικότητα των EPCs παρουσία εναιωρήματος και υπερκειμένου αιμοπεταλίων. Τέλος, η δράση της τικαγρελόρης και της αδενοσίνης μελετήθηκε στην ικανότητα των EPCs να ενσωματωθούν σε αγγειακές δομές σχηματίζοντας κυτταρικούς αυλούς και εκβλαστήματα από κυτταρικά σφαιρίδια. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν και σε ώριμα ενδοθηλιακά κύτταρα από ομφάλιο λώρο (HUVECs). Αποτελέσματα: Η τικαγρελόρη αύξησε την επαγόμενη από την ADP και το TRAP-6 μεμβρανική έκφραση του KDR στα CD34+ πρόδρομα κύτταρα, η οποία αυξήθηκε επιπλέον παρουσία του συνδυασμού της τικαγρελόρης με την αδενοσίνη, μια δράση που αναστάλθηκε παρουσία του αντιστρεπτού αγωνιστή και ανταγωνιστή του A2B υποδοχέα της αδενοσίνης (AR), MRS1706. Η τικαγρελόρη μείωσε την επαγόμενη από την ADP αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με τα CD34+ κύτταρα, ωστόσο, δεν είχε καμία δράση στην επαγόμενη από το TRAP-6 διακυτταρική αλληλεπίδραση. Επίσης, η τικαγρελόρη αύξησε την επαγόμενη από την ADP και το TRAP-6 αλληλεπίδραση των αιμοπεταλίων με τα CD34+/KDR+ κύτταρα, η οποία αυξήθηκε παρουσία της αδενοσίνης. Η τικαγρελόρη αύξησε τη μεμβρανική έκφραση του ICAM-1 παρουσία ενεργοποιημένων με ADP αιμοπεταλίων στα OECs, ένα φαινόμενο που παρατηρήθηκε παρουσία εν ηρεμία αιμοπεταλίων και όχι παρουσία ενεργοποιημένων με ADP αιμοπετάλια. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν τόσο για την έκκριση της PGI2 όσο και του MCP-1. Τέλος, η τικαγρελόρη αύξησε το σχηματισμό νέων κυτταρικών αυλών στα OECs, φαινόμενο που παρατηρήθηκε και παρουσία της αδενοσίνης. Επίσης, τόσο η τικαγρελόρη όσο και η αδενοσίνη αύξησαν το σχηματισμό εκβλαστημάτων σε κυτταρικά σφαιρίδια. Η συγκεκριμένη αύξηση αναστάλθηκα τόσο παρουσία του ανταγωνιστή του A2AAR, SCH58621, όσο και παρουσία του αντιστρεπτού αγωνιστή και ανταγωνιστή του A2BAR, MRS1706, ενώ ο συνδυασμός τους είχε πλήρη αναστολή του παραπάνω φαινομένου. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν και στα HUVECs. Συμπέρασμα: Η παρούσα μελέτη δείχνει πως η τικαγρελόρη επάγει τη διαφοροποίηση των CD34+ πρόδρομων κυττάρων σε EPCs, καθώς και την ενσωμάτωση αυτών σε αγγειακές δομές, φαινόμενα τα οποία πιθανότητα διαμεσολαβούνται από την αδενοσίνη, συμβάλλοντας με αυτόν τον τρόπο στην ενδοθηλιακή αναγέννηση και νεοαγγειογένεση. Επιπλέον, η παρούσα μελέτη δείχνει πως τα εν ηρεμία και όχι τα ενεργοποιημένα αιμοπετάλια επάγουν την ενεργοποίηση των EPCs. Το συγκεκριμένο γεγονός παρατηρείται και παρουσία της τικαγρελόρης, ακόμα και μετά την ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων, προτείνοντας ότι η τικαγρελόρη μπορεί να προάγει την αναγέννηση του ενδοθηλίου εμποδίζοντας την αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση, επιτρέποντας έτσι στα εν ηρεμία αιμοπετάλια να ενεργοποιήσουν τα EPCs.