Διερεύνηση παραγόντων που ελέγχουν τα επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων μεταγραφών που συνδέονται με την ανάπτυξη του ανθρώπινου σακχαρώδους διαβήτη τύπου 2

Abstract

Type 2 Diabetes mellitus (T2D) is a chronic metabolic disorder which is characterized by high blood glucose levels and associated with insulin resistance and/or insulin deficiency. During the last decade, over 60 Genome Wide Association Studies (GWAS) revealed more than 250 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) related to T2D or glycemic traits, with rather modest effect sizes in the disease risk. Due to the fact that the understanding of polygenic human diseases is attempted nowadays through the study of the transcriptome and epigenome, the aim of this thesis was to investigate the molecular profile of T2D patients through the study of genetic and epigenetic markers and explore possible associations with disease parameters and risk factors, applying high-throughput and highly sensitive molecular methodologies of RNA sequencing and quantification of gene expression levels. Initially, we focus on the study of the expression profile of 24 T2D susceptibility genes which are known from GWAS studies that bear SNPs associated with T2D development and/or characteristics of the disease. The expression profile of these genes was evaluated in the peripheral blood of well characterized T2D patients and healthy individuals. The results revealed that T2D patients exhibit differential expression patterns of specific transcript variants of the T2D susceptibility genes CAPN10, KCNQ1, CDK5, CDKN2A, THADA, and IGF2BP2, compared to healthy individuals. Furthermore, the mRNA levels of the transcript variants also correlated with certain clinicopathological parameters of the disease with different patterns between the two groups: T2D patients and healthy individuals. The next aim of this thesis was to investigate the regulation mechanisms of gene expression through the study of miRNAs which are experimentally validated to target the differentially expressed genes and to study the methylation profile of these genes in the peripheral blood of T2D patients and healthy individuals. These results revealed that the peripheral blood of T2D patients is characterized by decreased expression levels of the miRNAs: let-7b-5p, miR-1-3p, miR-24-3p, miR-34a-5p, miR-98-5p, miR133a-3p, and miR-125b-5p, compared to healthy individuals. Furthermore, the expression levels of these miRNAs correlated (positively or negatively) with the expression levels of their mRNA-targets as well as with certain clinicopathological parameters of the disease, even with different patterns between the groups. Finally, the study of methylation of the -differentially expressed- genes revealed that T2D patients exhibited general higher percentage of methylation in the promoter region of the gene CDK5, with statistically significant results for the position -271 (regarding Transcription Start Site), compared to healthy individuals. The data of this thesis revealed a T2D- specific genetic and epigenetic «signature» in the peripheral blood of T2D patients which can be related to the underlying pathophysiological mechanisms involved in the development of the disease and suggest the presence of complex molecular mechanisms that can regulate gene expression and can also be involved in the pathogenesis of the disease.

Ο Σακχαρώδης Διαβήτης τύπου 2 (ΣΔτ2) αποτελεί μια χρόνια μεταβολική πολυπαραγοντική διαταραχή που χαρακτηρίζεται από υψηλά επίπεδα γλυκόζης αίματος και συνδέεται με την ινσουλινοαντοχή ή/και με τη διαταραχή στους μηχανισμούς έκκρισης της ινσουλίνης. Κατά την τελευταία δεκαετία, πάνω από 60 μελέτες σάρωσης ολόκληρου του γονιδιώματος (Genome-Wide Association Studies-GWAS) αποκάλυψαν την παρουσία περισσότερων από 250 νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (Single Nucleotide Polymorphism-SNPs) που φαίνεται πως συνεισφέρουν στην αύξηση του κινδύνου εμφάνισης ΣΔτ2, με μικρή όμως επίδραση. Δεδομένου ότι η κατανόηση των πολυγονιδιακών νοσημάτων επιχειρείται σήμερα διαμέσου της συνδυαστικής μελέτης του μεταγραφώματος και του επιγενώματος, σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής τέθηκε η μελέτη του μοριακού προφίλ των ασθενών με ΣΔτ2 διαμέσου γενετικών και επιγενετικών δεικτών καθώς και η σχέση αυτών με συγκεκριμένους κλινικοπαθολογικούς και προδιαθεσικούς παράγοντες της νόσου, εφαρμόζοντας υψηλής ανάλυσης, σύγχρονες μεθοδολογίες αλληλούχησης και ποσοτικοποίησης γονιδίων. Αρχικός στόχος της διατριβής τέθηκε η μελέτη των επιπέδων έκφρασης 24 γονιδίων, τα οποία ήταν ήδη γνωστό από μελέτες GWAS ότι εμφανίζουν SNPs που σχετίζονται με τον αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης ΣΔτ2. Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων αυτών επιλέχθηκε να μελετηθούν στο περιφερικό αίμα καλά χαρακτηρισμένων ασθενών με ΣΔτ2 και υγιών δοτών. Τα αποτελέσματα ανέδειξαν ότι οι ασθενείς με ΣΔτ2 εμφανίζουν διαφορικά επίπεδα έκφρασης συγκεκριμένων μεταγράφων των γονιδίων CAPN10, KCNQ1, CDK5, CDKN2A, THADA και IGF2BP2, συγκρινόμενοι με τους υγιείς δότες. Τα επίπεδα έκφρασης των παραπάνω μεταγράφων συσχετίστηκαν επιπλέον με συγκεκριμένες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου και μάλιστα με διαφορετικό πρότυπο μεταξύ των ομάδων. Επόμενος στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής τέθηκε η διερεύνηση των μηχανισμών ρύθμισης της έκφρασης των γονιδίων που εμφάνισαν διαφορικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ των ομάδων διαμέσου της μελέτης των miRNAs, που επιβεβαιωμένα πειραματικά στοχεύουν τα γονίδια αυτά, και του προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών τους. Από τα αποτελέσματα αυτά προέκυψε ότι το περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΔτ2 χαρακτηρίζεται από μειωμένα επίπεδα έκφρασης των miRNAs: let-7b-5p, miR-1-3p, miR-24-3p, miR-34a-5p, miR-98-5p, miR133a-3p και miR-125b-5p, συγκρινόμενο με εκείνο των υγιών δοτών. Ακόμη, τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs που εμφάνισαν διαφορικά επίπεδα έκφρασης μεταξύ υγιών και ασθενών με ΣΔτ2 συσχετίστηκαν (θετικά ή αρνητικά) με τα επίπεδα έκφρασης των mRNAs-στόχων τους καθώς και με συγκεκριμένες κλινικοπαθολογικές παραμέτρους της νόσου και μάλιστα με διαφορετικό πρότυπο μεταξύ των ομάδων. Τέλος, η μελέτη του προφίλ μεθυλίωσης των υποκινητών των γονιδίων διαφορικής έκφρασης ανέδειξε οτι το γονίδιο CDK5 στους ασθενείς με ΣΔτ2 εμφανίζει μια τάση αύξησης του μέσου όρου του ποσοστού μεθυλίωσης στις υπό μελέτη θέσεις με σημαντικότερες διαφορές στη θέση της κυτοσίνης -271 (ως προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής), συγκριτικά με τους υγιείς δότες. Τα παραπάνω αποτελέσματα περιγράφουν μια -ειδική για το ΣΔτ2- γενετική και επιγενετική «υπογραφή» στο περιφερικό αίμα των ασθενών με ΣΔτ2, η οποία θα μπορούσε να συνδέεται με τους υποκείμενους παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς που εμπλέκονται στην ανάπτυξη του ΣΔτ2 και υποδηλώνει την ύπαρξη πολύπλοκων μηχανισμών που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και μπορούν επίσης να εμπλέκονται με τη σειρά τους στην παθογένεια της νόσου.