Πρώιμοι δείκτες υπερτασικής νεφροσκλήρυνσης

Abstract

Hypertension is a strong independent risk factor for Chronic Kidney Disease leading to hypertensive nephrosclerosis. Hypertensive nephrosclerosis, a multifactorial process not well understood, is the second most common cause of end-stage renal disease. In order to elucidate biological processes and macromolecules crucially involved in the development of kidney damage, the application of system biology approaches, like proteomics, is required. Applying proteomic analysis we aimed to identify novel markers associated with the pathogenesis and the development of hypertensive nephrosclerosis at very early stages in the well-established hypertensive animal model Spontaneously Hypertensive Rat (SHR).Blood pressure was measured in conscious SHR and Wistar Kyoto normotensive rat (WKY) animals using a tail-cuff technique. A comprehensive proteomic analysis of total kidney tissue from SHR and WKY animals at 6, 13, and 20 weeks of age was performed by two complementary methods, 2-Dimensional Gel Electrophoresis and Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS). Furthermore, using the novel technique Laser Capture Microdissection, renal vessels of SHR and WKY animals were isolated to almost total purity from kidney cryo-sections. Proteomic analysis (LC-MS) was performed aiming to detect molecular alterations associated with hypertension exclusively at the renal vessels before the onset of vascular damage.Proteomic analyses in whole kidney parenchyma and in the renal vessels generated a large amount of data that were analysed and compared. A large number (>200) of differentially expressed proteins emerged in hypertensive SHR animals in comparison to normotensive WKY animals. Two of them, CLIC4 and SGLT2, not implicated so far in the development of hypertensive nephrosclerosis were selected for further investigation and validation of proteomic results. Both of these proteins were upregulated in SHR animals at all three time intervals examined. The overexpression of CLIC4 and SGLT2 was confirmed by immunoassays and morphological techniques (western blot, immunohistochemistry, immunofluorescence). The results demonstrated that CLIC4 and SGLT2 were almost exclusively localized at the apical surface of the proximal tubular epithelial cells (brush border).Our studies suggest that major changes occur in the renal parenchyma of SHR animals at very early stages following the development of hypertension. Particularly, these data provide for the first time evidence that hypertension may generate dysfunction at the level of the proximal tubule. The specific localization of CLIC4 and SGLT2 at the luminal surface of proximal tubule epithelial cells raises the possibility that they may be detected in urine samples of hypertensive patients as well. In conclusion, our study suggest possible future use of CLIC4 and SGLT2 as early markers of renal damage during hypertension.

Η υπερτασική νεφροσκλήρυνση αποτελεί την δεύτερη αιτία, μετά τον διαβήτη, χρόνιας νεφρικής νόσου. Η πάθηση εξελίσσεται αθόρυβα σε ανεπάρκεια νεφρών και η διάγνωσή της είναι δύσκολη διότι δεν εμφανίζονται ειδικά συμπτώματα αλλά ούτε και μορφολογικές αλλοιώσεις στο νεφρικό παρέγχυμα στα αρχικά στάδια της ανάπτυξής της. Επιπλέον, δεν υπάρχουν αξιόπιστοι βιοδείκτες για την έγκαιρη εκτίμηση της νεφρικής βλάβης και οι ασθενείς εκδηλώνουν συμπτώματα όταν σχεδόν το 50% της λειτουργίας των νεφρών έχει χαθεί. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής είναι να βρεθούν πρώιμοι δείκτες που θα επιτρέπουν την έγκαιρη διάγνωση της υπερτασικής νεφροσκλήρυνσης και να αποσαφηνιστούν οι υποκείμενοι μηχανισμοί που οδηγούν στην εμφάνισή της και οι οποίοι σε μεγάλο βαθμό παραμένουν άγνωστοι. H καλύτερη προσέγγιση για την ανεύρεση τέτοιων πρωτεϊνών-δεικτών σε πολυπαραγοντικές παθολογικές καταστάσεις όπως η υπερτασική νεφροσκλήρυνση είναι η βιολογία συστημάτων και ειδικότερα η πρωτεομική ανάλυση. Καθώς η λήψη βιοψιών νεφρού είναι μια επίπονη εν πολλοίς μη ενδεικνυόμενη διαδικασία έχουν αναπτυχθεί διάφορα ζωικά μοντέλα μελέτης της υπέρτασης. Η μελέτη μας πραγματοποιήθηκε στο ευρέως διαδεδομένο υπερτασικό ζωικό μοντέλο Spontaneously Hypertensive Rat (SHR). Πραγματοποιήθηκαν τρεις διαφορετικές αλλά συμπληρωματικές πρωτεομικές προσεγγίσεις στο νεφρικό παρέγχυμα υπερτασικών SHR και νορμοτασικών WKY (Wistar Kyoto rats) ζώων ηλικίας 6, 13 και 20 εβδομάδων με στόχο την ανάλυση του πρωτεόματος του νεφρού σε βάθος. Από την ανάλυση των αποτελεσμάτων αναγνωρίστηκε πλήθος πρωτεϊνών με διαφορική έκφραση στα υπερτασικά ζώα και με πιθανό κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη της υπέρτασης. Η βιοπληροφορική ανάλυση κατέδειξε σημαντικά μονοπάτια που απορρυθμίζονται λόγω της υπέρτασης και τα οποία σχετίζονται με το οξειδωτικό στρες, την δυσλειτουργία των μιτοχονδρίων και την απόπτωση.Από τις διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες δύο ήταν εκείνες που παρουσίασαν μεγάλο ενδιαφέρον, η CLIC4 και η SGLT2. Η έκφραση και των δύο αυτών πρωτεϊνών βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στα υπερτασικά ζώα όλων των ηλικιών και επιλέχθηκαν ως πιθανοί πρώιμοι δείκτες υπερτασικής νεφροσκλήρυνσης που χρήζουν περαιτέρω μελέτης. Τα ευρήματα της πρωτεομικής επιβεβαιώθηκαν με βιοχημικές και μορφολογικές τεχνικές. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως η αυξημένη έκφραση τόσο της CLIC4 όσο και της SGLT2 εντοπίζεται στα επιθηλιακά κύτταρα των εγγύς εσπειραμένων σωληναρίων και ειδικότερα στην ψηκτροειδή παρυφή τους αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα μόρια αυτά μπορεί σε 13 παθολογικές καταστάσεις να εκκρίνονται στα ούρα μέσω εξωσωμάτων. Το γεγονός αυτό σε συνδυασμό με την επιβεβαίωση στο μέλλον των ευρημάτων και σε υπερτασικούς ασθενείς είναι πολύ σημαντικό καθώς μπορεί να ανοίξει το δρόμο σε νέους τρόπους διάγνωσης της υπερτασικής νεφροσκλήρυνσης σε πολύ πρώιμα στάδια και μάλιστα με μη επεμβατικό τρόπο.Συμπερασματικά, τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι πρώιμες αλλαγές συμβαίνουν στο σωληναριακό διαμέρισμα του νεφρού, και ότι οι αλλαγές αυτές είναι ειδικά εντοπισμένες στα εγγύς εσπειραμένα σωληνάρια. Είναι γνωστό πως τα σωληνάρια διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη νεφρική ανεπάρκεια και την οξεία νεφρική βλάβη ωστόσο, μέχρι τώρα δεν είχαν καταγραφεί τόσο πρώιμες μοριακές μεταβολές. Η μελέτη μας καταγραφεί για πρώτη φορά τέτοιες μεταβολές στα κύτταρα των εγγύς σωληναρίων στο μοντέλο SHR και μάλιστα πριν εκδηλωθούν οι τυπικές παθολογοανατομικές αλλαγές της υπερτασικής νεφροσκλήρυνσης.