Development and validation of LC-MS and NMR methods for the qualitative and quantitative determination of carotenoids in food and byproducts

Abstract

In recent years, consumers’ changing preferences created a new flourishing economybased on products containing natural extracts with health-promoting properties.Furthermore, as food-industry waste turns into a global concern, the valorization ofbioactive compounds from byproducts of plant or animal origin is an urgent need. In thisthesis, we studied the recovery of carotenoids from byproducts of plant (apricots) andanimal (shrimp head) natural substrates and lipid food matrices (egg yolk and shrimpbody) by implementing an integrated analytical platform including (a) experimental design(DOE)-based high energy extraction processes using conventional and innovative greenextraction solvents (natural deep eutectic solvents, NADES), (b) high throughputanalytical techniques (Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS/MS andΝuclear Μagnetic Resonance spectroscopy, NMR) and (c) multivariate unsupervised(PCA) and supervised (OPLS-DA) statistical analysis. In particular, ultrasound-assisted(UAE) and microwave-assisted extraction (MAE) were applied for the recovery ofcarotenoids from the examined substrates. The optimization of extraction conditions wascarried out by using a two-level screening (23 full factorial) model and a response surfacemethodology (RSM) model (Box-Behnken design). A LC-MS/MS method was developedfor the quantitation of carotenoids in order to determine the most efficient extractionapproach for each substrate. Moreover, 1D- and 2D-NMR spectroscopy were applied toobtain the metabolic fingerprint of apricot byproducts’ extracts in response to extractiontechniques and conditions. PCA and OPLS-DA models allowed the classification ofapricots extracts and provided information about co-extracted secondary metabolites. Tosum up, the current thesis provide a proof-of-concept for the future large-scaleimplementation of the developed analytical platform for the conversion of naturalbyproducts to high-added value nutraceuticals and for the commercial exploitation of lipidfoods of high bioactive content.

Τα τελευταία χρόνια, οι νέες καταναλωτικές συνήθειες έδωσαν ώθηση στην αγοράφυσικών προϊόντων με ευεργετικές ιδιότητες. Επιπρόσθετα, η αύξηση των φυσικώνπαραπροϊόντων καθιστά ως επιτακτική ανάγκη την αξιοποίησή τους μέσω τηςπαραλαβής βιοδραστικών ενώσεων από αυτά. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε ηανάκτηση καροτενοειδών από παραπροϊόντα φυτικής (βερίκοκα) ή ζωϊκής (κεφάλιγαρίδας) προέλευσης και από λιπιδικά τρόφιμα (κρόκος αυγών και σώμα γαρίδας)εφαρμόζοντας μια συνδυαστική αναλυτική προσέγγιση που περιλαμβάνει (α) εκχυλίσειςυψηλών ενεργειών με χρήση συμβατικών και καινοτόμων πράσινων διαλυτών (φυσικοίβαθιά ευτηκτικοί διαλύτες, NADES) και πειραματικού σχεδιασμού (DOΕ) (β)υγροχρωματογραφία συζευγμένη με φασματομετρία μάζας (LC-MS/MS) καιφασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και (γ) μοντέλωνπολυμεταβλητής στατιστικής ανάλυσης. Πιο συγκεκριμένα, εφαρμόστηκε εκχύλιση μευπερήχους (UAE) και με μικροκύματα (ΜΑΕ) για την παραλάβη καροτενοειδών από ταμελετούμενα υποστρώματα. Οι συνθήκες εκχύλισης βελτιστοποιήθηκαν με δυοδιαφορετικά DOE μοντέλα (23 full factorial design, Box-Behnken design). Η LC-MS/MSποσοτικοποίηση των καροτενοειδών υπέδειξε την καταλληλότερη μεθόδο εκχύλισης γιακάθε υπόστρωμα. Τα φάσματα NMR (1D-, 2D-NMR) ανέδειξαν το μεταβολικόαποτύπωμα των εκχυλισμάτων παραπροϊόντων βερίκοκου συναρτήσει των τεχνικών καισυνθηκών εκχύλισης. Η ταυτοποίηση των συνεκχυλιζόμενων μεταβολιτών υπεύθυνωνγια την ταξινόμηση των εκχυλισμάτων και η αξιολόγηση της επίδραση των συνθηκώνεκχύλισης σε αυτούς πραγματοποιήθηκε μέσω μοντέλων πολυμεταβλητής στατιστικήςανάλυσης (PCA, OPLS-DA). Συνοψίζοντας, η μελλοντική πιλοτική εφαρμογή τηςπαρούσας αναλυτικής μεθοδολογίας μπορεί να οδηγήσει στην μετατροπή τωνπαραπροϊόντων σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας και στην εμπορικήαξιοποίησή τους σε διάφορους τομείς της βιομηχανίας (τρόφιμα, φάρμακα, καλλυντικά,τροφοφάρμακα)