Διερεύνηση του ρόλου βιοδραστικών ενώσεων της διατροφής σε μοριακούς μηχανισμούς που έχουν σχέση με το οξειδωτικό στρες και την υγεία

Abstract

Mediterranean diet has been the subject of a large number of studies, particularly with regard to its role in human health. The present study started with the aim of evaluating the ability of extracts of three aromatic plants, sage, oregano and rosemary, to protect the cellular DNA, after exposure of cells to H2O2. The finding that aqueous extracts from these plants, as well as extracts from ethyl acetate, provided protection, led us to the isolation of some bioactive compounds and the investigation of their mechanisms of action. One of the investigated compounds was rosmarinic acid. It was observed that long-time incubations and high concentrations of rosmarinic acid, were required in order to be able to protect nuclear DNA. We hypothesized that rosmarinic acid due to its negative charge, can’t easily penetrate through cell membrane and act inside the cells. In order to neutralize its negative charge, we synthesized ester derivatives of rosmarinic acid which have higher lipophilicity. It was observed that their protective effects were much greater than that of the mother compound, rosmarinic acid. However, both esters examined, showed toxicity at high concentrations, in the absence of H2O2. Hypothesizing that this toxicity was due to the hydrolysis of esters within the cells of non – specific esterases, resulting in their accumulation in the cells, we then, chemically synthesized the corresponding amides of rosmarinic acid, which are not hydrolysed and subsequently are not entrapped inside the cells. It was observed that the amides had no toxicity in the absence of H2O2. Also, a strong correlation was observed between the capacity of binding intracellular redox active iron and the protective activity of these compounds. In conclusion, the above results demonstrate the importance of the esterification or amidation of phenolic acids in general, in order to be uptaken by the cells and act intracellularly. Thus, in order for a compound to be biologically active, it should: a) be able to be diffused into the cell interior and b) have the ability to bind the redox active iron ions. Then, we tried to evaluate the protective effects of extracts from industrially prepared functional dairy foods (cheese and yogurt), which were already enriched with extracts from aromatic plants and fruits. We concluded that the esters contained in the aromatic plant extracts and fruits extracts, are hydrolysed at the acid pH of the extraction of the dairy products and therefore, their constituents lose their protective capacity. In contrast, when the extraction is performed at neutral pH, ester hydrolysis is inhibited. In a final step, we turned our attention to in vivo actions of iron-binding compounds. In particular, we tried to evaluate the protection generated by two iron-binding pharmaceuticals, desferrioxamine and deferiprone, which have different lipophilicity and iron binding capacity, against reperfusion after a period of ischemia in liver. Initially, we observed that the protection of nuclear DNA in hepatic cells, in conditions of oxidative stress, was dramatically greater when the two compounds were combined, compared to that offered by each compound individually. To explain this effect, we hypothesized that deferiprone, being a more lipophilic compound, enters into the cells and binds redox active iron. Then, it transfers it out of the cell, delivering it to desferrioxamine, which has a much higher iron binding affinity. It is concluded that a plethora of components of the diet with specific chemical characteristics, can exert beneficial effects on many pathological conditions, contributing to the preservation of human health.

Η Μεσογειακή διατροφή έχει αποτελέσει αντικείμενο μεγάλου αριθμού μελετών, κυρίως όσον αφορά το ρόλο της στην ανθρώπινη υγεία. Η παρούσα μελέτη ξεκίνησε με στόχο την αξιολόγηση της ικανότητας εκχυλισμάτων τριών αρωματικών φυτών, φασκόμηλου, ρίγανης και δεντρολίβανο, που αποτελούν συστατικά της, να προστατεύουν το κυτταρικό DNA μετά από έκθεση των κυττάρων σε Η2Ο2. Η διαπίστωση ότι τα υδατικά εκχυλίσματα καθώς και αυτά από οξικό αιθυλεστέρα προσέφεραν προστασία, οδήγησε στην απομόνωση και τον έλεγχο του μηχανισμού δράσης μιας βιοδραστικής ένωσης που περιέχεται σε αυτά, του ροσμαρινικού οξέος. Παρατηρήσαμε ότι για να μπορέσει το ροσμαρινικό οξύ να προστατεύσει το πυρηνικό DNA απαιτεί μεγάλο χρονικό διάστημα και υψηλές συγκεντρώσεις . Με στόχο λοιπόν, την εξουδετέρωση του αρνητικού φορτίου, συντέθηκαν αρχικά χημικά παράγωγα του ροσμαρινικού οξέος και συγκεκριμένα εστέρες, οι οποίοι παρουσίαζαν αυξημένη λιποφιλικότητα. Η προστατευτική τους δράση ήταν πολύ μεγαλύτερη σε σχέση με το ροσμαρινικό οξύ, ωστόσο σε υψηλότερες συγκεντρώσεις παρουσίαζαν τοξικότητα, απουσία Η2Ο2. Πιθανολογώντας ότι η τοξικότητα αυτή οφείλεται στην υδρόλυση των εστέρων στο εσωτερικό των κυττάρων από μη - ειδικές εστεράσες, με επακόλουθο τη συσσώρευσή τους εντός των κυττάρων, συνθέσαμε χημικά και τα αντίστοιχα αμίδια του ροσμαρινικού οξέος, τα οποία δεν υδρολύονται και κατά συνέπεια δεν εγκλωβίζονται στο εσωτερικό των κυττάρων. Παρατηρήθηκε ότι τα αμίδια δεν είχαν τοξικότητα στις συγκεκριμένες συγκεντρώσεις απουσία Η2Ο2. Επίσης, παρατηρήθηκε μια ισχυρή συσχέτιση της ικανότητας δέσμευσης καταλυτικά ενεργών ενδοκυττάριων ιόντων σιδήρου και της προστατευτικής δράσης των ενώσεων αυτών όσον αφορά τις βλάβες του πυρηνικού DNA από το Η2Ο2. Συμπερασματικά, από τα παραπάνω αποτελέσματα καταδεικνύεται η σημασία της εστεροποίησης ή αμιδίωσης των φαινολικών οξέων για την πρόσληψή τους από τα κύτταρα και τις ενδοκυτταρικές τους δράσεις, όπως επίσης και ότι για να μπορεί μια ένωση να είναι βιολογικά ενεργή θα πρέπει: α) να μπορεί να διαχέεται στο εσωτερικό των κυττάρων και β) να έχει την ικανότητα να δεσμεύει τα καταλυτικά ενεργά ιόντα σιδήρου. Στη συνέχεια, προσπαθήσαμε να αξιολογήσουμε την προστατευτική δράση εκχυλισμάτων από βιομηχανικά παρασκευασμένα λειτουργικά γαλακτοκομικά τρόφιμα (τυριά και γιαούρτια), τα οποία είχαν προηγουμένως εμπλουτιστεί με εκχυλίσματα αρωματικών φυτών και με φρούτα. Συμπεράναμε ότι οι εστέρες που περιέχονται στα εκχυλίσματα των αρωματικών φυτών και στα φρούτα υδρολύονται στο όξινο pH της εκχύλισης των γαλακτοκομικών προϊόντων και κατά συνέπεια, τα φορτισμένα συστατικά τους δεν μπορούν να εισέλθουν εντός των κυττάρων. Αντίθετα, στο ουδέτερο pH εκχύλισης έχουμε λιγότερες ή καθόλου υδρολύσεις, με αποτέλεσμα τα συστατικά των εκχυλισμάτων να μην είναι αρνητικά φορτισμένα και να μπορούν να διαχυθούν εντός των κυττάρων και να προστατεύσουν τα κυτταρικά συστατικά. Σε ένα τελευταίο στάδιο, στρέψαμε την προσοχή μας σε in vivo δράσεις σιδηροδεσμευτικών ενώσεων, της δεσφεριοξαμίνης και της δεφεριπρόνης, που έχουν διαφορετική λιποφιλικότητα και ικανότητα δέσμευσης σιδήρου, όταν αυτά χορηγούνται πριν την επαναιμάτωση μετά από μία περίοδο ισχαιμίας. Παρατηρήσαμε ότι η προστασία του πυρηνικού DNA ηπατικών κυττάρων σε συνθήκες οξειδωτικού στρες ήταν εντυπωσιακά μεγαλύτερη από το συνδυασμό των ενώσεων σε σχέση με την προστασία που προσέφερε κάθε μία ένωση ξεχωριστά. Συνοψίζοντας τα παραπάνω, προκύπτει ότι η λιποφιλικότητα και η ικανότητα δέσμευσης σιδήρου καθορίζουν την ικανότητα των ενώσεων να προστατεύουν τα ενδοκυττάρια συστατικά σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Τέλος, από τα αποτελέσματα αυτής της διατριβής θα μπορούσε να βγει το συμπέρασμα ότι πολλά από τα συστατικά της διατροφής με συγκεκριμένα χημικά χαρακτηριστικά, θα μπορούσαν να ασκήσουν ευεγερτική δράση στην αντιμετώπιση και βελτίωση πολλών παθολογικών καταστάσεων, συμβάλλοντας στη διατήρηση της ανθρώπινης υγείας.