Συστημική ανάλυση έκφρασης και λειτουργίας μοριακών στόχων που εμπλέκονται στην κυτταρική μετανάστευση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση: έλεγχος του ενδεχόμενου ρόλου τους στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως και σε καρδιαγγειακά νοσήματα

Abstract

Within the last years, systems medicine has emerged as a holistic approach to tackle complex diseases, such as cancer and cardiovascular disease. High-throughput omics approaches are integral part of systems approaches and among them proteomics has a central role. Tissue proteomics may provide a wealth of information on the molecular mechanisms of such complex diseases thus contributing to the identification of novel druggable targets for therapeutic interventions. Bladder cancer is the most costly and second in mortality among urogenital cancers. Patients with advanced stages of bladder cancer are characterized by poor outcome which can be partially explained by the limited therapeutic options. This indicates an imperative need for the identification of novel druggable targets. To this end, this study has focused on the characterization of the global proteomic changes underlying bladder cancer invasion at the tissue level. By performing a comprehensive proteomic analysis, 144 proteins were found to be significantly differentially expressed between muscle invasive and non-muscle invasive bladder cancer tissues. Several of these proteins had been previously reported in the context of bladder cancer, such as annexins, alpha actinins, TGFBI, cadherins and cathepsins, increasing the validity of this approach. Remarkably, this study also revealed numerous novel findings such as the differential expression of FUCA1, BROX, PGRMC1, and PSMD12 in invasive bladder cancer which was further confirmed by immunohistochemistry. In silico analysis of the differentially expressed proteins predicted, among others, a significant activation of protein synthesis. EIF3D and RHEB, both associated with translation, were prioritized for functional analysis in vitro and in vivo. Knock-down of EIF3D in the metastatic bladder cancer cell line T24M, inhibited cell proliferation, migration and colony formation in vitro and consequently led to a decrease of tumor growth in vivo. Similar biological effect was observed upon the knock-down of RHEB in vitro yet not in vivo. Therefore, in this study, EIF3D was highlighted as a novel candidate involved in bladder cancer invasion having also a therapeutic potential. On the other hand, cardiovascular disease is the leading cause of death worldwide with a high mortality rate and an increasing incidence annually. Atherosclerosis, the major cause of cardiovascular disease, is a chronic, systemic disease with a long-lasting subclinical phase. Early detection and treatment of patients with atherosclerosis are crucial in order to reduce the burden of the disease. To this end, and specifically aiming to gain insight into the early cardiovascular disease mechanisms, in this study, a systematic approach based on mouse models, human tissues and in vitro studies, was applied. Proteome analysis using high-resolution tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) of thoracic aortas from atherosclerotic mice models, Ldlr-/- and ApoE-/-, in the presence or absence of diabetes was performed. One hundred seventy-seven proteins were found to be differentially expressed in all models in comparison to wild type (WT) animals, suggesting that these changes were associated with atherosclerosis, regardless of the molecular background of the model used. These proteins segregated into atherosclerosis relevant processes including metabolism, hemostasis, immune system, extracellular matrix and chromatin organization. Further LC-MS/MS experiments using human vessels from patients with cardiovascular disease and controls, confirmed the upregulation of six proteins that were identified also in mice. Among them, KDM5D, an epigenetic modulator – member of the KDM5 family of histone demethylases, exhibited pronounced overexpression in disease. Along the same lines, a reduction of the trimethylated form of H3K4, which is the substrate of KDM5 demethylases, was detected in the same samples using Western blot analyses. Further functional interference studies showed an impact of KDM5 inhibition on human endothelial (HUVEC) cells, including a reduction of cell proliferation, migration and tube-forming ability in vitro. In conclusion, the data of this study support a role for KDM5 histone demethylases in the development of cardiovascular disease, likely via affecting H3K4 methylation. The proteomics findings of this study hold the promise to further support systems biology investigations in the future.

Tα τελευταία χρόνια η Συστημική Ιατρική έχει αναδειχθεί ως μια ολιστική προσέγγιση για την αντιμετώπιση σύνθετων νοσημάτων, όπως είναι ο καρκίνος και οι καρδιαγγειακές παθήσεις. Αναπόσπαστο κομμάτι των συστημικών προσεγγίσεων αποτελούν οι τεχνολογίες –ωμικής υψηλής ευκρίνειας, με την Πρωτεωμική να καταλαμβάνει κεντρικό ρόλο. Οι πρωτεωμικές αναλύσεις σε επίπεδο ιστού παρέχουν πλούτο πληροφορίας αναφορικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν τα σύνθετα νοσήματα συμβάλλοντας επομένως στην ανάδειξη νέων στόχων για θεραπευτικές παρεμβάσεις. Ο καρκίνος της ουροδόχου κύστεως αποτελεί τον πιο δαπανηρό και δεύτερο σε θνησιμότητα καρκίνο του ουρογεννητικού συστήματος. Οι ασθενείς με προχωρημένα στάδια της νόσου χαρακτηρίζονται από δυσμενή έκβαση που μπορεί, εν μέρει, να εξηγηθεί από τις περιορισμένες θεραπευτικές επιλογές που υπάρχουν. Επομένως, είναι επιτακτική η ανάγκη για την ανεύρεση νέων θεραπευτικών στόχων. Για το σκοπό αυτό, η παρούσα μελέτη επικεντρώθηκε στο χαρακτηρισμό των πρωτεωμικών αλλαγών σε επίπεδο ιστού που ευθύνονται για τη μεταστατικότητα του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως. Για αυτό το λόγο πραγματοποιήθηκε συγκριτική πρωτεωμική ανάλυση μεταξύ μη διηθητικών και διηθητικών όγκων ουροδόχου κύστεως μέσω της οποίας εντοπίστηκαν 144 διαφορικά εκφραζόμενες πρωτεΐνες. Μεταξύ αυτών περιλαμβάνονταν πρωτεΐνες, όπως οι αννεξίνες, α-ακτινίνες, TGFBI, καντχερίνες και καθεψίνες, που είχαν προηγουμένως συσχετιστεί με τον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως, ενισχύοντας περαιτέρω την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων αυτής της προσέγγισης. Αξίζει να σημειωθεί, ότι σε αυτή τη μελέτη αναδείχθηκαν επίσης και πολλά νέα ευρήματα μεταξύ των οποίων οι πρωτεΐνες FUCA1, BROX, PGRMC1 και PSMD12 που επιβεβαιώθηκαν ως προς τη διαφορική τους έκφραση στα διαφορετικά στάδια της νόσου, με ανοσοϊστοχημεία. Μέσω in silico ανάλυσης των διαφορικά εκφραζόμενων πρωτεϊνών προβλέφθηκε, μεταξύ άλλων, σημαντική ενεργοποίηση της πρωτεϊνοσύνθεσης στους διηθητικούς καρκίνους. Οι παράγοντες EIF3D και RHEB, οι οποίοι σχετίζονται με τη μετάφραση, επιλέχθηκαν για περαιτέρω λειτουργική ανάλυση in vitro και in vivo. Η καταστολή της έκφρασης του EIF3D στη μεταστατική κυτταρική σειρά ουροδόχου κύστεως T24M είχε σαν αποτέλεσμα τη μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μεταναστευτικότητας και της ικανότητας σχηματισμού αποικιών in vitro, καθώς και μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των όγκων in vivo. Συγκρίσιμα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν in vitro αλλά όχι in vivo, έπειτα από καταστολή της έκφρασης του RHEB. Ως εκ τούτου, σε αυτή τη μελέτη, αναδείχθηκε ο παράγοντας EIF3D ως νέο υποψήφιο μόριο που εμπλέκεται στη μετάσταση του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως και που εν δυνάμει μπορεί να αποτελέσει στόχο για θεραπευτική παρέμβαση. Από την άλλη πλευρά, τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν την κυριότερη αιτία θανάτου παγκοσμίως με ένα υψηλό ποσοστό θνησιμότητας και μια αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης ετησίως. Η αθηροσκλήρωση αποτελεί την κυριότερη αιτία εμφάνισης καρδιαγγειακών νοσημάτων και είναι μια χρόνια, συστημική νόσος που πολλές φορές παραμένει ασυμπτωτική κατά το αρχικό στάδιο. Δεδομένου ότι τα καρδιαγγειακά νοσήματα αποτελούν κύριο παράγοντα επιβάρυνσης της παγκόσμιας υγείας, η έγκαιρη ανίχνευση και θεραπεία των ασθενών με αθηροσκλήρωση κρίνεται απαραίτητη. Προς αυτή την κατεύθυνση, στην παρούσα μελέτη, επιδιώχθηκε η κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν τα καρδιαγγειακά νοσήματα, μέσω μιας συστημικής προσέγγισης βασισμένης σε ζωικά πρότυπα, δείγματα ανθρώπινων ιστών και in vitro μελέτες. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε πρωτεωμική ανάλυση χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας τύπου LC-MS/MS σε δείγματα θωρακικών αορτών από πρότυπα αθηροσκληρωτικών μυών, Ldlr - / - και ApoE - / -, παρουσία ή απουσία διαβήτη. Εκατόν εβδομήντα επτά πρωτεΐνες εντοπίστηκαν διαφορικά εκφραζόμενες στα ζωικά πρότυπα που ελέγχθηκαν σε σύγκριση με τα ζώα άγριου τύπου (WT), υποδηλώνοντας ότι οι μεταβολές αυτές εμπλέκονται στην αθηροσκλήρωση, ανεξάρτητα από το γενετικό υπόβαθρο του προτύπου που χρησιμοποιήθηκε. Οι πρωτεΐνες αυτές διαπιστώθηκε ότι εμπλέκονται σε διεργασίες που σχετίζονται με την αθηροσκλήρωση όπως ο μεταβολισμός, η αιμόσταση, το ανοσοποιητικό σύστημα, η εξωκυττάρια ουσία και η οργάνωση της χρωματίνης. Επιπρόσθετα, με LC-MS/MS ανάλυση που πραγματοποιήθηκε σε αγγεία ασθενών με καρδιαγγειακά νοσήματα επιβεβαιώθηκε η υπερέκφραση 6 πρωτεϊνών που είχαν ανιχνευτεί επίσης και στα ζώα. Μεταξύ αυτών, ο KDM5D, ένας επιγενετικός ρυθμιστής - μέλος της οικογένειας των KDM5 απομεθυλασών των ιστονών, παρουσίαζε έντονη υπερέκφραση στα δείγματα των ασθενών συγκριτικά με τα δείγματα των φυσιολογικών μαρτύρων. Αντιστοίχως, στα ίδια δείγματα, με ανοσοαποτύπωση κατά Western ανιχνεύθηκε και μείωση των επιπέδων της τριμεθυλιωμένης μορφής της Η3Κ4, η οποία είναι το υπόστρωμα των KDM5 απομεθυλασών. Περαιτέρω λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι η αναστολή των KDM5 απομεθυλασών στα κύτταρα HUVEC επέφεραν μείωση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της ικανότητας σχηματισμού αγγείων in vitro. Συμπερασματικά, τα δεδομένα αυτής της μελέτης υποστηρίζουν την εμπλοκή των KDM5 απομεθυλασών των ιστονών στην ανάπτυξη των καρδιαγγειακών νοσημάτων, πιθανότατα μέσω της τροποποίησης του προτύπου μεθυλίωσης της H3K4. Επιπλέον, τα ευρήματα της πρωτεωμικής αυτής μελέτης δύναται να αποτελέσουν τη βάση σε περαιτέρω προσεγγίσεις Συστημικής Βιολογίας.