Η καλλιέργεια Μικροφυκών στην επεξεργασία λυμάτων για παραγωγή βιομάζας και λιπιδίων και η επίδραση των νανοσωματιδίων ZnO στην ανάπτυξη των μικροφυκών

Abstract

The purpose of this dissertation was to study the development of appropriate microalgae cultures for simultaneous wastewater treatment and lipid production with the ultimate goal of reducing the cost of producing microalgae biomass and using it for biodiesel production. Due to the increasing use of nanoparticles in industrial and domestic applications and the availability of much more nanoparticles (NPs) in wastewater treatment plants (WWTPs) and then in the environment, it is considered urgent to investigate the impact of NPs on the food chain micro-aquatic ecosystems. Despite the rapid increase in the use of NPs, their monitoring and control is still incomplete, while limited information on their possible effects is available. In the present thesis, it was chosen to investigate the effect of ZnO nanoparticles, which are also one of the most widely used nanoparticles.The limited stock of conventional energy sources is the main reason why it makes it necessary to turn into alternative energy sources. Microalgae are one of the most promising alternative sources for biofuel production. Unlike other crops currently used to produce biofuels, such as soybean oil, palm oil and corn oil, certain algal strains contain up to 70% lipids. In addition, microalgae use CO2 as a source of carbon for growth, which results in reducing greenhouse gas emissions. Cultivation of microalgae for wastewater treatment and biofuel production is a method that needs to be further investigated in terms of their effectiveness.For this purpose, the present thesis focused on the identification of the algal species living in the wastewater environment. Samples from two WWTPs were taken and microalgae species were identified. The results showed that flora and fauna differed in both WWTPs although they were geographically close and similar climatic conditions prevail. Then, 10 species of high-lipid microalgae were selected based in the existing literature. The selected species were cultured in bioreactors for 30 days, and monitored for biomass growth and nutrient removal capacity. From these cultures, it emerged that the removal of nutrients depended on the requirements of each algal and differed from species to species. The highest increase in biomass was observed with the marine species. Three types of freshwater were selected and further studied due to their presence in wastewater environment. The three species were studied for nutrient removal, biomass growth, and lipid content with synthetic substrate. The results have shown that biomass development is not always directly linked to nutrient removal, nor to the lipid content of algae. Therefore, the choice of algal species to be used for a culture is also determined by how culture and biomass are used and exploited.Chlorococcum sp. were further investigated, in order to determine the factors that effect the growth of microalgae. The factors studied included: (i) the initial biomass concentration, (ii) the CO2 supply, (iii) the source and duration of illumination, (iv) the initial concentration of nitrates and phosphates in the substrate, and (v) the culture volume. The results of this study have shown that the lipid content of microalgae depends on the nutrient concentration in the substrate and particularly increases with nitrates deficiency. The low CO2 supply in a crop can also be a limiting factor in the development of microalgae with high biomass concentration. The continuous light source operation throughout the day resulted in a better performance of the microalgae growth, while the stability of radiation provided by artificial light resulted in higher microalgae growth than solar radiation. The high initial biomass concentration of microalgae resulted in a lower growth rate, but at a much higher final biomass concentration, compared to cultures with low initial microalgae concentration.In the next step Chlorococcum sp. were cultivated with primary and secondary treated wastewater. Cultures were performed in a laboratory-scale pond, and the effect of feed conditions (batch, semi-continuous, continuous), hydraulic residence time (HRT), and light intensity were studied. The removal of phosphates in cultures reached up to 100%, while phosphorus deficiency prevented the removal of nitrates from sewage. Low HRT resulted in the increase of biomass, while the increase of the radiation intensity increased the concentration of chl-a. The results of FAMEs and biodiesel produced from lipids of microalgae showed that they had a high content of saturated fatty acids, which their methyl esters increase the number of cetanes, reduce nitrogen oxides (NOx) and improve the stability of biodiesel.The treatment of primary treated wastewater was conducted with a mixed cultivation of autochthonous microalgae from the WWTP of the University of Patras.The cultivation was performed on a 30-L pond and the effect of feed conditions (batch, semi-continuous, continuous) and light intensity were examined. The removal of nutrients from the system reached levels of up to 52 and 100%, for nitrates and phosphates, respectively. The lipid content of microalgae biomass was 15%, corresponding to the lipid content of the single-cultures of Chlorococcum sp.Finally, the present study investigated the short-term and long-term toxicity of ZnO NPs in freshwater microalgae (Chlorococcum sp. and Scenedesmus rubescens). In conclusion, the effect of NPs ZnO on algae depends on the algae species, the concentration of NPs, the composition of the nutrient medium and the exposure time. The behavior of microalgae under short and long-term NPs exposure varied significantly, and initially for specific NPs concentrations the toxic effect was high (complete inhibition of growth) over time but it was observed that microalgae showed the ability to recover with time. This indicates the need for further study of NPs toxicity in microalgal sewage treatment systems over a longer period of time and NPs concentrations observed in the aquatic environment.

Το αντικείμενο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη ανάπτυξης καλλιεργειών καταλλήλων μικροφυκών για την ταυτόχρονη επεξεργασία λυμάτων και παραγωγή λιπιδίων με απώτερο σκοπό την μείωση του κόστους της παραγωγής βιομάζας από μικροφύκη και τη χρησιμοποίησή της για παραγωγή βιοντίζελ. Εξαιτίας της αυξανόμενης χρήσης των νανοσωματιδίων (ΝΣ) σε βιομηχανικές και οικιακές εφαρμογές και τη διάθεση όλο και περισσοτέρων νανοσωματιδίων σε εγκαταστάσεις επεξεργασίας λυμάτων (ΕΕΛ) και στη συνέχεια στο περιβάλλον, θεωρήθηκε επιτακτική η ανάγκη της διερεύνησης των επιπτώσεων των νανοσωματιδίων στη βάση της τροφικής αλυσίδας των υδάτινων οικοσυστημάτων που είναι τα μικροφύκη. Παρά τη ραγδαία όμως αύξηση της χρήσης των νανοσωματιδίων η παρακολούθηση και ο έλεγχός τους εξακολουθεί να είναι ελλιπής, ενώ παράλληλα ελάχιστες είναι οι διαθέσιμες πληροφορίες για τις πιθανές επιδράσεις τους. Στην παρούσα διατριβή επιλέχθηκε να διερευνηθεί η επίδραση των νανοσωματιδίων ZnO, τα οποία είναι και ένα από τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα νανοσωματίδια.Τα περιορισμένα αποθέματα των συμβατικών πηγών ενέργειας είναι ο βασικός λόγος που καθιστά αναγκαία τη στροφή του ανθρώπου σε εναλλακτικές πηγές ενέργειας. Τα μικροφύκη αποτελούν μία από τις πλέον υποσχόμενες εναλλακτικές πηγές για την παραγωγή βιοκαυσίμων. Σε αντίθεση με άλλες καλλιέργειες που χρησιμοποιούνται σήμερα για την παραγωγή βιοκαυσίμου, όπως σογιέλαιο, φοινικέλαιο και αραβοσιτέλαιο ορισμένα στελέχη φυκών περιέχουν έως και 70% λιπίδια. Επιπλέον, τα μικροφύκη χρησιμοποιούν CO2 ως πηγή άνθρακα για να αναπτυχθούν και αυτό έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση των εκπομπών CO2 που συμβάλουν στο φαινόμενο του θερμοκηπίου. Η καλλιέργεια μικροφυκών για την επεξεργασία λυμάτων και την παραγωγή βιοκαυσίμου αποτελεί μια μέθοδο που χρήζει περαιτέρω διερεύνηση σε ότι αφορά την αποτελεσματικότητά τους.Για αυτό το σκοπό στην παρούσα διατριβή αρχικά έγινε η αναγνώριση των ειδών των μικροφυκών που διαβιούν στο περιβάλλον των λυμάτων από δύο ΕΕΛ. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χλωρίδα και η πανίδα διαφέρει στις δύο ΕΕΛ παρόλο που βρίσκονται γεωγραφικά κοντά και επικρατούν παρόμοιες κλιματολογικές συνθήκες. Στη συνέχεια επιλέχθηκαν 10 είδη μικροφυκών με υψηλή περιεκτικότητα λιπιδίων βάσει της υπάρχουσας βιβλιογραφίας. Στα είδη που επιλέχθηκαν πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρες για 30 ημέρες και πραγματοποιήθηκε η παρακολούθηση της αύξησης της βιομάζας και η ικανότητα αφαίρεσης θρεπτικών του κάθε μικροφύκους. Από τις καλλιέργειες αυτές, προέκυψε ότι η αφαίρεση των θρεπτικών εξαρτάται από τις απαιτήσεις του κάθε μικροφύκους και διαφέρει από είδος σε είδος. Τη μεγαλύτερη αύξηση βιομάζας παρουσίασαν τα είδη των αλμυρών υδάτων αλλά για περαιτέρω μελέτη επιλέχθηκαν τρία είδη γλυκού νερού που συναντώνται και στο περιβάλλον των λυμάτων. Τα τρία είδη που επιλέχθηκαν χρησιμοποιήθηκαν σε μεγαλύτερου όγκου καλλιέργειες και μελετήθηκαν για την ικανότητα αφαίρεσης θρεπτικών, την αύξηση της βιομάζας τους και την περιεκτικότητα λιπιδίων με συνθετικό υπόστρωμα. Τα αποτελέσματα από τη μελέτη αυτών των τριών ειδών έδειξαν ότι η ανάπτυξη βιομάζας δεν είναι πάντα άμεσα συνδεδεμένη με την αφαίρεση θρεπτικών, αλλά ούτε και με την περιεκτικότητα των φυκών σε λιπίδια. Από τα δεδομένα συμπεραίνεται ότι η επιλογή του φύκους που θα χρησιμοποιηθεί για κάποια καλλιέργειας καθορίζεται και από τον τρόπο χρησιμοποίησης και αξιοποίησης της καλλιέργεια και της παραγόμενης βιομάζας.Στη συνέχεια επιλέχθηκε το μικροφύκος Chlorococcum sp. προκειμένου να γίνει η περαιτέρω μελέτη της επίδρασης των παραγόντων που επηρεάζουν την αύξησή του. Οι παράγοντες που μελετήθηκαν ήταν: i) η αρχική συγκέντρωση της βιομάζας, ii) η παροχή CO2, iii) η πηγή και η διάρκεια φωτισμού, iv) η αρχική συγκέντρωση νιτρικών και φωσφορικών στο υπόστρωμα και v) ο όγκος της καλλιέργειας. Τα αποτελέσματα αυτού του σταδίου μελέτης έδειξαν ότι η περιεκτικότητα των λιπιδίων των μικροφυκών εξαρτάται από την συγκέντρωση θρεπτικών στο υπόστρωμα και συγκεκριμένα αυξάνεται όταν υπάρχει έλλειψη νιτρικών. Η μικρή παροχή CO2 σε μια καλλιέργεια μπορεί να είναι και περιοριστικός παράγοντας στην ανάπτυξη των μικροφυκών με υψηλή συγκέντρωση βιομάζας. Η συνεχής παροχή φωτός καθ’ όλη τη διάρκεια της ημέρας οδήγησε σε καλύτερη απόδοση στην ανάπτυξη των μικροφυκών, ενώ η σταθερότητα της ακτινοβολίας που παρείχε το τεχνητό φως είχε σαν αποτέλεσμα την καλύτερη ανάπτυξη των μικροφυκών απ’ ότι η ηλιακή ακτινοβολία. Η υψηλή αρχική συγκέντρωση βιομάζας μικροφυκών οδήγησε σε μικρότερο ρυθμό ανάπτυξης, αλλά σε αρκετά μεγαλύτερη τελική συγκέντρωση βιομάζας, συγκρινόμενη με καλλιέργειες που είχαν χαμηλή αρχική συγκέντρωση μικροφυκών.Έπειτα, έγινε ο έλεγχος της προσαρμογής και της απόδοσης των Chlorococcum sp. σε καλλιέργειες με πρωτοβάθμια και δευτεροβάθμια επεξεργασμένα λύματα. Οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε εργαστηριακής κλίμακας λίμνες και μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών τροφοδότησης (διαλείποντος έργου, ημι-συνεχής, συνεχής), ο υδραυλικός χρόνος παραμονής (ΥΧΠ) και η ένταση ακτινοβολίας του φωτός. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αφαίρεση των φωσφορικών στις καλλιέργειες έφτασε έως και 100%, ενώ η έλλειψη φωσφόρου παρεμπόδιζε την αφαίρεση των νιτρικών από τα λύματα. Ο χαμηλός ΥΧΠ είχε σαν αποτέλεσμα την αύξηση της βιομάζας, ενώ με την αύξηση της έντασης ακτινοβολίας αυξήθηκε και η συγκέντρωση της χλωροφυλλης α (chl-a) στην καλλιέργεια. Τα αποτελέσματα των FAMEs και του παραγόμενου βιοντίζελ από την καλλιέργεια σε λύματα έδειξαν ότι τα μικροφύκη είχαν υψηλή περιεκτικότητα σε κορεσμένα λιπαρά οξέα των οποίων οι μεθυλεστέρες τους αυξάνουν τον αριθμό κετανίων, μειώνουν τα οξείδια αζώτου (ΝΟx) και βελτιώνουν την σταθερότητα του βιοντίζελ.Επίσης, πραγματοποιήθηκε η μελέτη μικτής καλλιέργειας αυτοχθόνων μικροφυκών από την εγκατάσταση επεξεργασίας λυμάτων του Πανεπιστημίου Πατρών για την επεξεργασία πρωτοβάθμια επεξεργασμένων λυμάτων και την παραγωγή λιπιδίων. Η καλλιέργεια πραγματοποιήθηκε σε τεχνητή λίμνη των 30 L και μελετήθηκε η επίδραση των συνθηκών τροφοδότησης (διαλείποντος έργου, ημι-συνεχής, συνεχής) και της έντασης ακτινοβολίας του φωτός. Η απομάκρυνση θρεπτικών από το σύστημα έφθασε σε επίπεδα έως και 52 και 100%, για τα νιτρικά και τα φωσφορικά, αντίστοιχα. Η έλλειψη φωσφορικών στα λύματα είχε σαν αποτέλεσμα και το μικρό ποσοστό αφαίρεσης των νιτρικών. Η περιεκτικότητα λιπιδίων της βιομάζας των μικροφυκών ήταν 15%, αντίστοιχη με την περιεκτικότητα λιπιδίων της μονοκαλλιέργειας των Chlorococcum sp. Τέλος, στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε η βραχεία και μακροχρόνια έκθεση των μικροφυκών γλυκού νερού (Chlorococcum sp. και Scenedesmus rubescens) σε ΝΣ ZnO. Συμπερασματικά, η επίδραση των NΣ ZnO στα φύκη εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το είδος του φύκους, τη συγκέντρωση των NΣ, τη σύνθεση του θρεπτικού μέσου και το χρόνο έκθεσης. Η συμπεριφορά των μικροφυκών υπό βραχεία και μακροχρόνια έκθεση σε ΝΣ διέφερε σημαντικά και ενώ αρχικά για συγκεκριμένες συγκεντρώσεις ΝΣ η τοξική επίδραση ήταν υψηλή (πλήρης παρεμπόδιση ανάπτυξης) με την πάροδο του χρόνου παρατηρήθηκε ότι τα μικροφύκη παρουσίασαν την ικανότητα να επανέλθουν. Αυτό δείχνει την ανάγκη για περαιτέρω μελέτη της τοξικότητας ΝΣ σε συστήματα επεξεργασίας λυμάτων με μικροφύκη για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα και συγκεντρώσεις ΝΣ που παρατηρούνται στο υδάτινο περιβάλλον.