Μελέτη της σχέσης δομής - δραστικότητας της Ε3 λιγάσης oυβικιτίνης Arkadia

Abstract

Arkadia/RNF111 is the first E3 ubiquitin ligase that has been found to positively regulate the TGF-beta pathway by targeting for ubiquitin dependent degradatation the Smad7, SnoN (SkiL) and SKI negative regulators. E3 ubiquitin ligase activity of Arkadia depends on its C-terminal RING-H2 domain. Three dimensional structure determination and interaction studies of the RING-H2 domain of Arkadia with the E2 enzyme UbcH5b revealed highly conserved amino acids among the RING-H2 domains that are implicated in the interaction with the E2 enzyme. Moreover, using deep sequencing analysis of human mRNA from tumors of colorectal cancer (CRC) patients led to identification of point mutations in the C-terminus that reduce Arkadia functions. In this thesis the impact of the mutation of the conserved amino acids of Phe964 and Trp972, that are found in the interacting surface of Arkadia RING domain, was studied. Moreover, subject of the study was the impact of the Arg957Cys point mutation, which was found in tumors of patients with CRC. The impact of each point mutation in the structure and the interaction ability with the E2 enzyme UbcH5b was estimated through Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy. Additionally, a polypeptide that comprises the 124-residues of the C-terminal of Arkadia was studied via NMR spectroscopy and sequences outside the RING that bind UbcH5b enzyme through distinct interfaces, resulting in higher affinity, were identified. The E3 ubiquitin ligase function of the polypeptides was estimated through auto-ubiquitination and luciferase assays.

Η πρωτεΐνη Arkadia/RNF111 είναι η πρώτη Ε3 λιγάση ουβικιτίνης η οποία αναγνωρίστηκε ότι ρυθμίζει θετικά το TGF-β μονοπάτι σηματοδοτώντας για αποικοδόμηση τους αρνητικούς ρυθμιστές του μονοπατιού Smad7, SnoN (SkiL) και SKI. Η Arkadia επιτελεί τη δράση της μέσω της RING-Η2 επικράτειά της την οποία φέρει στο C-τελικό της άκρο. Ο προσδιορισμός της δομής και η μελέτη της αλληλεπίδρασης με το Ε2 ένζυμο UbcH5b του πολυπεπτιδικού τμήματος των 68 καταλοίπων, το οποίο έφερε τη RING επικράτεια, ανέδειξε συντηρημένα κατάλοιπα για τις RING-Η2 Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης τα οποία εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση με το Ε2 ένζυμο UbcH5b. Επιπλέον μελέτες αλληλούχισης γονιδιώματος (deep sequencing) του mRNA ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου υπέδειξαν την ύπαρξη μεταλλάξεων εντός της RING επικράτειας της Arkadia όπως η μετάλλαξη της Arg σε Cys στη θέση 957 της ακολουθίας της. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης μεταλλάξεων σε συντηρημένα κατάλοιπα όπως η Trp στη θέση 972 και η Phe στη θέση 964 της ακολουθίας. Επιπρόσθετα, πραγματοποιήθηκε η μελέτη της επίδρασης της μετάλλαξης Arg957Cys η οποία έχει ανιχνευθεί σε ιστούς ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου. Η αποτίμηση της επίδρασης των μεταλλάξεων στη δομή καθώς και οι μελέτες αλληλεπίδρασης των μεταλλαγμάτων με το Ε2 ένζυμο UbcH5b πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού. Επιπρόσθετα, μελετήθηκε μέσω φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού το πολυπεπτιδικό τμήμα των 124 καταλοίπων το οποίο αποδείχθηκε ότι φέρει ακολουθίες σημαντικές για την αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης με το UbcH5b και τη λειτουργία της ως λιγάση στο μονοπάτι της ουβικιτινίωσης. Η λειτουργικότητα των μελετώμενων πολυπεπτιδίων της Arkadia ως Ε3 λιγάσες ουβικιτίνης ελέγχθηκε μέσω πειραμάτων αυτο-ουβικιτινίωσης και δοκιμασίας λουσιφεράσης.