Unraveling the biological role of two putative polysaccharide deacetylases from Bacillus anthracis

Abstract

Bacillus anthracis, a Gram-positive, spore-forming bacterium, is a potential bioterrorism weapon. Ingestion or inhalation of B. anthracis spores can lead to anthrax disease in mammalian hosts which, in most cases, proves to be fatal. Presently used antibiotics to combat B. anthracis infections exhibit low potency against B. anthracis strains that show antimicrobial resistance, necessitating the need to identify new targets and to develop novel antibacterial drugs against this pathogen. Putative and known polysaccharide deacetylases (PDAs) from B. anthracis are validated drug targets due to their key roles in bacterial physiology. PDAs have been implicated in lysozyme resistance and also participate in distinct cellular functions including cell division/elongation, cell shape maintenance and osmotic stability, biofilm formation and adhesion/invasion to host cells. PDAs are members of the carbohydrate esterase family 4 (CE4) which includes acetylxylan esterases, chitin deacetylases, chitooligosaccharide deacetylases and peptidoglycan (PG) deacetylases.There is an unusual occurrence of eleven putative PDAs in B. anthracis. Except from the characterized active PDAs, B. anthracis also possesses putative pseudoPDAs. Pseudoenzymes are defined as enzyme homologues that are predicted to retain protein expression, subcellular localization and typical protein folding but lack catalytic activity. Different roles of pseudoenzymes have been reported including regulation of their active homologues, interaction with the substrates of their enzyme homologues, binding and targeting of other proteins to specific cellular locations, modulation of protein ubiquitination and signal transduction. Here we elucidated the physiological role of the putative PDAs BA1836 and BA3943 from B. anthracis by employing biochemical and genetic (knockout) analysis. The ba1836 gene is expressed upon entrance into the stationary phase of growth and enhanced during the early stages of sporulation. Δba1836 knockout strain had normal growth rate, did not exhibit any significant alterations in PG composition of stationary phase cells and was not sensitive to lysozyme, but showed a defect in cell separation. Strikingly, the Δba1836 mutant strain exhibited a severe delay in spore development although mature spores were ultimately developed and exhibited normal morphology. Finally, digestion of mutant spore PG with muramidase produced similar but less muropeptides compared to PG from wild type spores, and mutant spores exhibited a lower germination rate. Our in vitro data demonstrated that BA3943 is a pseudoenzyme consistent with the absence of three conserved, essential, catalytic residues. In addition, BA3943 lacks hydroxylation at the Cα of a highly conserved Pro residue of the active site, which has been recently shown to enhance the enzymatic activity of PDAs from B. anthracis. The crystal structure revealed the presence of a lysine-rich domain at the N-terminus of the pseudoPDA. The lysine-rich domain is unique and to our knowledge it has not been identified in any other enzyme family. Site-directed mutagenesis at the three residues of the active site of BA3943 resulted in restoration of both deacetylase activity and hydroxylation levels. The ba3943 gene is expressed upon entrance into the engulfment stage of sporulation. Interestingly, the Δba3943 mutant strain exhibited a significant competition deficit under sporulation-inducing conditions, suggesting that BA3943 is actively involved in sporulation. Nevertheless, Δba3943 mature spores were ultimately developed, exhibited normal morphology and could efficiently sporulate and germinate. Finally, a Δba3943 knockout strain had normal growth rate, did not exhibit any significant alterations in PG composition of stationary phase cells or spores and was not sensitive to lysozyme, but showed a defect in cell separation. To our knowledge BA1836 has a unique, sporulation/germination-specific role among the functions of other PDAs, while BA3943 is the first characterized pseudoPDA which affects the sporulation process in B. anthracis. Our data provide information towards a more complete understanding of the complex processes of sporulation and germination in this bacterial pathogen.

Ο Bacillus anthracis, ένα θετικό κατά Gram βακτήριο που έχει την ικανότητα να σχηματίζει σπόρια, χρησιμοποιείται ως βιολογικό όπλο σε τρομοκρατικές ενέργειες. Η κατάποση ή η εισπνοή των σπορίων του B. anthracis προκαλεί την ασθένεια του άνθρακα, η οποία, τις περισσότερες φορές, οδηγεί στο θάνατο του ξενιστή. Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται για την καταπολέμηση της ασθένειας του άνθρακα, παρουσιάζουν μειωμένη δραστικότητα σε ανθεκτικά στελέχη B. anthracis, καθιστώντας απαραίτητη την ανάγκη για την ταυτοποίηση νέων στόχων και την ανάπτυξη νέων αντιμικροβιακών φαρμάκων για το συγκεκριμένο παθογόνο. Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών του B. anthracis αποτελούν στόχους αντιβιοτικών λόγω των σημαντικών τους ρόλων στη φυσιολογία του συγκεκριμένου παθογόνου. Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα του B. anthracis στη λυσοζύμη του ξενιστή καθώς και σε άλλες κυτταρικές λειτουργίες όπως στη βιογένεση της πεπτιδογλυκάνης κατά την επιμήκυνση και την κυτταρική διαίρεση, στη διατήρηση του κυτταρικού σχήματος και στην διατήρηση της κυτταρικής σταθερότητας παρουσία υψηλής οσμωτικής πίεσης, στο σχηματισμό βιοφίλμ αλλά και στην προσκόλληση και εισβολή στα κύτταρα του ξενιστή. Οι απακετυλάσες πολυσακχαριτών είναι μέλη της οικογένειας 4 των εστερασών υδατανθράκων (CE4) στην οποία ανήκουν οι εστεράσες ακετυλ-ξυλάνης, οι απακετυλάσες χιτίνης, οι απακετυλάσες χιτοολιγοσακχαριτών και οι απακετυλάσες πεπτιδογλυκάνης. Εξαιρετικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι το γονιδίωμα του B. anthracis περιέχει έντεκα γονίδια τα οποία κωδικοποιούν για πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών. Εκτός από τις ενεργές απακετυλάσες, ο B. anthracis διαθέτει και ψευδο-απακετυλάσες πολυσακχαριτών. Τα ψευδο-ένζυμα αποτελούν ομόλογα ενζύμων τα οποία διατηρούν την γονιδιακή έκφραση, τον κυτταρικό εντοπισμό και την χαρακτηριστική πρωτεϊνική αναδίπλωση των ενεργών τους ομόλογων ενζύμων όμως έχουν χάσει την καταλυτική τους δράση. Τα ψευδο-ένζυμα εμπλέκονται σε διαφορετικές κυτταρικές διεργασίες όπως στη ρύθμιση των ενεργών ομόλογών τους ή στην αλληλεπίδραση με τα υποστρώματα αυτών ή στην πρόσδεση και στόχευση πρωτεϊνών σε συγκερκιμένα υποκυτταρικά διαμερίσματα ή στην ρύθμιση της ουβικουιτινιλίωσης πρωτεϊνών ή στη μεταγωγή σήματος.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε ο ρόλος των πιθανών απακετυλασών πολυσακχαριτών ΒΑ1836 και ΒΑ3943 στη φυσιολογία του B. anthracis πραγματοποιώντας βιοχημική και γενετική ανάλυση. Το γονίδιο ba1836 εκφράζεται κατά την είσοδο των κυττάρων στη στατική φάση ανάπτυξης και επάγεται κατά τα πρώτα στάδια της σπορίωσης. Το στέλεχος B. anthracis στο οποίο είχαμε διαγράψει το γονίδιο ba1836 (Δba1836) εμφάνισε φυσιολογικό ρυθμό ανάπτυξης, δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στην σύσταση της πεπτιδογλυκάνης κυττάρων στατικής φάσης ανάπτυξης και δεν ήταν ευαίσθητο στη λυσοζύμη, όμως έδειξε αδυναμία διαχωρισμού των κυτταρικών αλυσίδων σε σύγκριση με το στέλεχος αγρίου τύπου. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι το μεταλλαγμένο στέλεχος Δba1836 παρουσίασε σημαντική καθυστέρηση στη δημιουργία των σπορίων, παρότι τα ώριμα σπόρια εμφάνισαν φυσιολογική μορφολογία. Τέλος, η υδρόλυση της πεπτιδογλυκάνης των ώριμων μεταλλαγμένων σπορίων με μουραμιδάση παρήγαγε παρόμοια αλλά ποσοτικά μειωμένα μουροπεπτίδια σε σύγκριση με την πεπτιδογλυκάνη των σπορίων του αγρίου τύπου ενώ τα μεταλλαγμένα σπόρια παρουσίασαν χαμηλότερο ρυθμό εκβλάστησης. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης αποδεικνύουν ότι η ΒΑ3943 είναι μία ψευδο-απακετυλάση πολυσακχαριτών. Τρία συντηρημένα και απαραίτητα για την κατάλυση αμινοξέα απουσιάζουν από το ενεργό της κέντρο με αποτέλεσμα να μην εμφανίζει δράση απακετυλάσης. Επιπλέον, απουσιάζει η υδροξυλίωση στον Cα της συντηρημένης προλίνης του ενεργού της κέντρου η οποία πρόσφατα βρέθηκε ότι ενισχύει την ενζυμική δράση των απακετυλασών πολυσακχαριτών του B. anthracis. Επίσης, η κρυσταλλική δομή της ΒΑ3943 αποκάλυψε την παρουσία μίας περιοχής πλούσιας σε λυσίνες στο άμινο-τελικό της άκρο. Η περιοχή αυτή είναι μοναδική καθώς δεν έχει βρεθεί σε καμία άλλη οικογένεια ενζύμων εώς τώρα. Κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση στις τρεις συντηρημένες αμινοξικές θέσεις του ενεργού κέντρου της ΒΑ3943 οδήγησε σε επαναφορά των δράσεων της απακετυλίωσης και των επιπέδων της υδροξυλίωσης. Το γονίδιο της ba3943 εκφράζεται στη σπορίωση, κατά την είσοδο των κυττάρων στο στάδιο της εγκόλπωσης. Μεγάλο ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός ότι το στέλεχος B. anthracis στο οποίο είχαμε διαγράψει το γονίδιο της ba3943 (Δba3943) εμφάνισε σημαντικό μειονέκτημα κατά τον συναγωνισμό με κύτταρα αγρίου τύπου σε συνθήκες σπορίωσης, υποδεικνύοντας ότι η ΒΑ3943 εμπλέκεται ενεργά στη διαδικασία αυτή. Εντούτοις, τα ώριμα σπόρια εμφάνισαν φυσιολογική μορφολογία και ήταν ικανά να εκβλαστήσουν. Τέλος, το μεταλλαγμένο Δba3943 στέλεχος είχε φυσιολογικό ρυθμό ανάπτυξης, δεν παρουσίασε σημαντικές διαφορές στην σύσταση της πεπτιδογλυκάνης κυττάρων στατικής φάσης ανάπτυξης αλλά και ώριμων σπορίων και δεν ήταν ευαίσθητο στη λυσοζύμη, όμως έδειξε αδυναμία διαχωρισμού των κυτταρικών αλυσίδων σε σύγκριση με το στέλεχος αγρίου τύπου Ο ρόλος της ΒΑ1836 στη σπορίωση και στην εκβλάστηση είναι μοναδικός ανάμεσα στις λειτουργίες των υπόλοιπων απακετυλασών πολυσακχαριτών ενώ η ΒΑ3943 αποτελεί μία ψευδο-απακετυλάση, η οποία επηρεάζει τη σπορίωση του B. anthracis. Η παρούσα διδακτορική διατριβή παρέχει πληροφορίες οι οποίες θα συνεισφέρουν στην κατανόηση των πολύπλοκων διαδικασιών της σπορίωσης και εκβλάστησης του συγκεκριμένου παθογόνου.