Biochemical and biophysical study of two putative polysaccharide deacetylases: their role in osmotic stress and cell shape maintenance in the bacterium Bacillus anthracis

Abstract

Bacillus anthracis is a Gram-positive, spore forming bacterium and the etiological agent of anthrax, a lethal disease sporadically affecting humans and animals. The cell wall of B. anthracis is composed of peptidoglycan, polysaccharides, proteins and a poly-γ-D-glutamic acid capsule.Bacterial lipoproteins are a functionally diverse class of peripheral membrane proteins in Gram-positive bacteria, with important roles in substrate binding for ABC transporters, adhesion, antibiotic, lantibiotic and bacteriocin resistance and phage superinfection, cell envelope homeostasis, protein secretion, folding and localization, redox and sensory processes, including signaling in sporulation and germination.Polysaccharide deacetylases belong to Carbohydrate Esterase Family 4 (CE4). Interestingly, the genomes of Bacillus sp., and especially of B. cereus sensu lato, including B. anthracis contain multiple putative polysaccharide deacetylase genes with high sequence homologies. The physiological role of five polysaccharide deacetylases in B. anthracis has been recently elucidated.The structures of CE4 enzymes from various bacterial species have been determined and they all contain a conserved NodB homology domain and adopt a (α/β)8 barel fold. Most of the structures contain a divalent cation in the active site bound in a His-His-Asp triad. The catalytic machinery is completed by an aspartic acid and a histidine which act as the catalytic base and catalytic acid respectively.BA0330 and BA0331 from B. anthracis are predicted as putative lipoproteins and polysaccharide deacetylases and share 55% sequence identity. Furthermore, BA0330 shares 91% identity with its corresponding homologue BC0361 from B. cereus, while a homologue of BA0331, which is present in all B. anthracis strains, is missing in many B. cereus strains including B. cereus ATCC 14579. BA0331 is mainly expressed during exponential phase, but is secreted at lower amounts during the stationary phase, in both the avirulent B. anthracis UM23C1-2 (pXO1-, pXO2-) and the wild-type virulent Vollum strain.In this study we employed biochemical and genetic (knockout) analysis and protein localization to elucidate the biological roles of BA0330 and BA0331 from the avirulent B. anthracis UM23C1-2 strain. Although both proteins lack deacetylase activity towards commonly used deacetylase substrates, the construction of both single Δba0330 and Δba0331 and double Δba0330Δba0331 mutants revealed a significant role for the two proteins in maintaining cell wall integrity.Electron Microscopy revealed that the mutant cells exhibited aberrant phenotypes. In Δba0330 cells a partial detachment of the membrane from the cell wall was observed, probably due to a weakened interaction between the two layers. Furthermore Δba0330 cells exhibited impaired growth rate compared to wild type cells, when challenged with increased NaCl concentrations, indicating that BA0330 contributes to the adaptation of the bacterium to high salt stress. On the contrary, Δba0331 cells had normal peptidoglycan-membrane connection but were unable to maintain the typical bacilli shape, exhibiting a distorted cell shape, a finding which was confirmed by both Transmission and Scanning Electron Microscopy. To examine the importance of the putative deacetylase activity of the proteins in vivo, a point mutation was introduced in ba0330 and ba0331 to replace key catalytic residues. The distorted phenotypes of Δba0330 and Δba0331 were restored when the mutant cells were complemented with the point mutated BA0330 and BA0331 proteins respectively.Both proteins were located in the cell envelope but exhibited different localization patterns: BA0330 is localized in the cell periphery and enhanced at the septa and BA0331 in distinct foci with lower representation at the septa. Both BA0330 and BA0331 interact with peptidoglycan, thus reinforcing their implication in stabilizing the cell wall of B. anthracis. Furthermore, both proteins may affect the function of autolysins, since Δba0330 and to a lesser extent Δba0331 mutant strains showed decreased autolysis.Although BA0330 and BA0331 contain most of the catalytic and zinc binding residues conserved in five catalytic motifs of enzymatically and structurally characterized CE4 esterases, the recently solved structure of BA0330 revealed that the catalytic site differs from that typically found in polysaccharide deacetylases and could explain the apparent lack of activity of this protein.To our knowledge this is the first report of lipoproteins implicated in maintenance of cell wall integrity in Gram-positive bacteria.

Οι απακετυλάσες Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης των πολυσακχαριτών ανήκουν στην οικογένεια των εστερασών CE4, η οποία περιλαμβάνει ένζυμα που χαρακτηρίζονται απο σημαντική ομολογία και λειτουργικές ομοιότητες. Αποτελεί εξαιρετικό ενδιαφέρον το γεγονός οτι τα γονιδιώματα του Bacillus cereus και του συγγενικού παθογόνου Bacillus anthracis περιέχουν 10 και 11 γονίδια αντίστοιχα με υψηλή ομολογία μεταξύ τους που κωδικοποιούν για πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών. Πρόσφατα μελετήθηκε ο βιολογικός ρόλος για 5 απο αυτές. Οι αιτίες ύπαρξης τόσο μεγάλου αριθμού γονιδίων που κωδικοποιούν για πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών στο γονιδίωμα του B. anthracis, σε αντίθεση με άλλα παθογόνα βακτήρια που διαθέτουν μικρότερο αριθμό αντίστοιχων γονιδίων αποτελεί βασική αναζήτηση της παρούσας μελέτης.Tα γονίδια ba0330 και ba0331 αποτελούν τα δυο μοναδικά ανοιχτά πλαίσια ανάγνωσης απο τα 11 που περιέχει ο B. anthracis που εκτός απο πιθανές απακετυλάσες πολυσακχαριτών κωδικοποιούν και για πιθανές λιποπρωτείνες και μοιράζονται 55% ομολογία μεταξύ τους. Οι λιπορωτείνες των βακτηρίων αποτελούν μια οικογένεια μεμβρανικών πρωτεινών με ποικίλους ρόλους στα κατά Gram θετικά βακτήρια. Για την διαλεύκανση του βιολογικού ρόλου των παραπάνω ενζύμων ακολουθήθηκε συνδυασμός βιοχημικών και μοριακών τεχνικών καθώς και ο κυτταρικός εντοπισμός τους στο βακτήριο B. anthracis.Συνοψίζοντας τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι παρόλο που στις δύο πρωτείνες δεν ανιχνεύθηκε ενεργότητα Ν- απακετυλάσης σε ενζυμικές δοκιμές με συνήθη υποστρώματα απακετυλασών, η κατασκευή των μεταλλαγμάτων Δba0330, Δba0331 και Δba0330Δba0331 έδειξε ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην διατήρηση της ακεραιότητας του κυτταρικού τοιχώματος του βακτηρίου. Συγκεκριμένα η διαγραφή του γονιδίου ba0330 απο το γονιδίωμα του B. anthracis έδειξε ότι οδηγεί στην εμφάνιση μερικής αποκόλλησης μεταξύ μεμβράνης και πεπτιδογλυκάνης, πιθανά λόγω αποδυνάμωσης της αλληλεπίδρασης μεταξύ των δύο στρωμάτων. Επίσης τα κύτταρα του στελέχους Δba0330 είχαν πολύ χαμηλό ρυθμό ανάπτυξης συγκρινόμενα με κύτταρα αγρίου τύπου σε θρεπτικό μέσο με αυξημένη συγκέντρωση NaCl, συσχετίζοντας έτσι την BA0330 με την προσαρμογή του βακτηρίου σε συνθήκες υψηλής αλατότητας. Κατά την διαγραφή του γονιδίου ba0331 παρατηρήθηκε αδυναμία του στελέχους να διατηρήσει το χαρακτηριστικό σχήμα του βακίλου, με αποτέλεσμα την εμφάνιση άτυπων κυτταρικών σχημάτων. Προκειμένου να διαπιστωθεί κατα πόσο οι φαινότυποι των μεταλλαγμάτων μπορούν να αποδωθούν σε πιθανή ενεργότητα Ν-απακετυλάσης, σημιακές μεταλλαγές εισήχθησαν στα δυο γονίδια σε καθοριστικά κατάλοιπα για την διατήρηση της πιθανής ενεργότητας. Τα μεταλλλαγματα Δba0330 και Δba0331 στα οποία εκφράστηκαν οι αντίστοιχες πρωτείνες που έφεραν την σημιακή μετάλλαξη ανέκτησαν πλήρως τα χαρακτηριστικά του στελέχους αγρίου τύπου.Επίσης οι δύο πρωτείνες εντοπίζονται σε διαφορετικά σημεία του κυτταρικού φακέλου: η ΒΑ0330 εντοπίζεται στην περιφέρεια του κυττάρου, ενώ η ΒΑ0331 εντοπίζεται σε διακριτά σημεία. Παράλληλα και οι δύο πρωτείνες αλληλεπιδρούν με την πεπτιδογλυκάνη του βακτηρίου.Παρόλο που η ΒΑ0330 και η ΒΑ0331 διαθέτουν τα περισσότερα απο τα κατάλοιπα των μελών της CE4 οικογένειας που έιναι απαραίτητα και συντηρημένα για την κατάλυση, η πρόσφατη επίλυση της δομής της ΒΑ0330 έδειξε κάποιες διαφοροποιήσεις στον καταλυτικό μηχανισμό, στις οποίες θα μπορούσε να αποδωθεί η πιθανή έλλειψη ενεργότητας.Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής παρέχουν καινοτόμες και θεμελιώδεις πληροφορίες σχετικά με τον ρόλο των λιποπρωτεινών στα κατά Gram θετικά βακτήρια, καθώς για πρώτη φορά καταδεικνύεται ο ρόλος που παίζουν στην διατήρηση της ακεραιότητας των κυτταρικών τοιχωμάτων.