Ανοσογενετική: έλεγχος αμφισβητούμενης πατρὀτητας - μητρότητας: σύγκριση δυο προσπελάσεων

Abstract

Paternity testing requires the use of polymorphic genetic loci, inherited according to Mendel's laws and determined by accurate and reproducible methods. Αutosomal Short Tandem Repeats (aSTRs) and Human Leukocyte Antigens (HLA) constitute genetic systems widely used in disputed paternity/maternity assessment. Both systems have disadvantages: linkage disequilibrium, predominance of certain alleles in particular ethnic groups for HLA, and high mutation rate affected by parental age and sex for aSTRs. The aim of the present study was to evaluate the use of polymorphic microsatellite marker DNA analysis and to establish this analysis as the method of choice for parentage investigations. Material and methods: Among 792 civil disputed parentage tests addressed to Immunology and Histocompatibily lab of Evangelismos General Hospital previously examined for HLA class I (-A*, -B*, -Cw*), and class II (-DRB1*, -DQB1*, -DPB1*) alleles using PCR-SSOP and/or PCR-SSP methodologies (low/high resolution), a cohort of 147 cases (405 individuals, 110trios/37duos) was selected, (including one DNA grandparent testing). DNA-typing was generated from co-amplification of 15-16 aSTRs and the sex determining Amelogenin marker, using Fragment Analysis methodology by DNA sequencing on 3130 Genetic Analyzer. Genomic DNA was isolated from either whole blood or buccal swabs. Power of Exclusion (PE), Random Man Not Excluded (RMNE), Combined Parentage Index (CPI), and Probability of Parentage (W) values were calculated by Buckleton (aSTRs) and Essen-Möller (HLA) values, based on allele frequency of Caucasoid population database. Results: DNA polymorphism analysis was informative for both exclusion and confirmation of the disputed paternity. 38 out of 147 (28trios/10duos) cases were sufficient for exclusion of fatherhood (at least 3 genetic aSTRs loci) and 108 (82trios/26duos) were not excluded. The results of both approaches (HLA and aSTRs) were in agreement and the combined discriminating power of the two methods resulted in assigning paternity for all cases, except in one, where the two alleged fathers were relatives. In this case, there was exclusion by aSTRs, but not by HLA. The low W rates (0.9870-0.9999) using HLA typing were increased up to 0.9999999 using aSTRs. The CPI by aSTR genotyping was ranged from 333 (duo) to 6.76x10^13 (trio) with statistically significant difference between trios and duos (p<0.0001), RMNE was ranged from 1.14x10^-5 to 9.64x10^-13, p<0.0001, while PE was estimated up to 0.999999 using aSTRs. Additionally, seven aSTRs mutations (2 on D12S391 and 1 for each SE33, D10S1248, vWA, D2S1338, D21S11 locus) and 1 null allele (SE33) were observed in 8 (8/188, 4.26%) different parent/child allele transfers (2 of them was motherless case), without ruling out fatherhood. All mutations were single or double-step (repeat loss or gain). The ratio of paternal versus maternal mutations/null allele was 7:1 (p=0.036). In the above cases, HLA approach was used for paternity confirmation (W ranged from 0.9972 to 0.9999). No parental exclusion was confirmed by both approaches. However, despite the presence of mutations in those cases, the low W, as determined by aSTRs (0.9970-0.9999), was increased up to 0.99999999 using both systems. Conclusions: The above results underline the usefulness and power of the DNA-based methods and approaches in the field of disputed paternity. The use of DNA-typing with 15-16 aSTRs loci provides an accurate and high-sensitivity method which is easier to perform and more rapid than an accepted standard technology, such as HLA genotyping. It offers a highly discriminating test suitable for trio paternity testing, increasing the W rate in comparison to HLA genotyping, and is useful in cases whereas the maternal DNA is not available or tested individuals originate from the same lineage. Nevertheless, when a mutation/null event occurs in motherless cases, combination of HLA and aSTRs polymorphisms offers high level of information, and also diminishes the possibility of false exclusion due to aSTRs mutations/nulls, or minimizes the risk of wrong inclusion due to the absence of mother’s genotype.

Ο έλεγχος αμφισβητούμενης γονικότητας απαιτεί τη χρήση πολύμορφων γενετικών τόπων που κληρονομούνται σύμφωνα με τους νόμους του Mendel και καθορίζονται με ακριβείς και αναπαραγώγιμες μεθόδους. Οι μικρές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αυτοσωμικού DNA (aSTRs) και τα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (HLA) αποτελούν γενετικά συστήματα που χρησιμοποιούνται ευρέως στον έλεγχο αμφισβητούμενης γονικότητας. Ωστόσο, τόσο το HLA σύστημα, όσο και οι aSTRs γενετικοί πολυμορφισμοί φέρουν μειονεκτήματα όπως: ανισορροπία γενετικής σύνδεσης και επικράτηση ορισμένων αλληλομόρφων σε συγκεκριμένες πληθυσμιακές ομάδες (HLA) και υψηλό ποσοστό μετάλλαξης που επηρεάζεται από την ηλικία και το φύλο των γονέων (aSTRs). Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση της χρήσης των aSTRs γενετικών δεικτών και η εφαρμογή της ανάλυσής τους ως μέθοδος εκλογής στην διερεύνηση αμφισβητούμενης γονικότητας. Υλικό και μέθοδοι: Μεταξύ 792 περιπτώσεων αμφισβητούμενης γονικότητας Αστικού Δικαίου, καταχωρημένες στα αρχεία του Τμήματος Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας του ΓNA «Ο Ευαγγελισμός», επιλέχθηκε μία ομάδα 147 περιπτώσεων διερεύνησης γονικότητας (405 άτομα Ελληνικής καταγωγής, ήτοι 110trios/37duos, εκ των οποίων η μία πραγματοποιήθηκε μέσω των γονέων του εκλιπόντος ΦΠ απουσία και του DNA της μητέρας). Η γονοτύπηση των δειγμάτων έγινε σε g-DNA από δείγματα περιφερικού αίματος ή/και παρειακού επιχρίσματος ως προς: α) HLA τάξης Ι (-Α*, -Β*, -Cw*) και τάξης II (-DRB1*, -DQB1*, -DPB1*) αλλήλια με τη χρήση μοριακών τεχνικών (PCR-SSOP και/ή PCR-SSP) σε επίπεδο χαμηλής/υψηλής ανάλυσης. β) 16-17 aSTRs πολυμορφισμούς (συμπεριλαμβανομένου και του γενετικού τόπου για τον καθορισμό του φύλου-Amelogenin) εφαρμόζοντας Fragment Analysis μεθοδολογία σε 3130 γενετικό αναλυτή. Οι δείκτες Power of Exclusion (PE), Random Man Not Excluded (RMNE), Combined Parentage Index (CPI) και Probability of Parentage (W) υπολογίστηκαν με βάση την συχνότητα των HLA και aSTRs αλληλίων στους Καυκάσιους. Αποτελέσματα: Σε 38 περιπτώσεις (28trios/10duos) αποδείχτηκε ο αποκλεισμός της γονικότητας, με τεκμήρια αποκλεισμού σε ≥3 aSTRs, >1 HLA. Σε 108 περιπτώσεις (82trios/26duos) η γονικότητα δεν αποκλείστηκε. Τα αποτελέσματα ανάλυσης μέσω και των δύο οδών προσπέλασης συμφωνούσαν οδηγώντας στην ανάθεση της γονικότητας σε όλες τις περιπτώσεις, εκτός από μία που οι ελεγχόμενοι ΦΠ είχαν συγγενική σχέση μεταξύ τους (υπήρξε αποκλεισμός από τα aSTRs, όχι από τα HLA). Οι χαμηλές τιμές WHLA:0,9870-0,9999 αυξήθηκαν έως και 0,9999999 μέσω των aSTRs. Οι δείκτες γονικότητας κυμάνθηκαν: α) Οι CPISTRs από 333 (duo) έως 6,76x10^13 (trio) με στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ trios και duos (p<0,0001). β) Οι RMNEaSTRs (1,14x10^-5 - 9,64x10^-13) (p<0,0001). γ) Οι PEaSTRs ξεπέρασαν το 0,999999. Επιπλέον, κατεγράφησαν επτά aSTRs μεταλλάξεις (D12S391 (2), SE33, D10S1248, vWA, D2S1338, D21S11) και 1 σιωπηλό αλλήλιο (SE33) σε ισάριθμες περιπτώσεις αμφισβητούμενης γονικότητας (8/188, 4,26%) (6trios/2duos) και αποδόθηκαν σε απώλεια ή προσθήκη μίας ή δύο τετρανουκλεοτιδικών επαναλήψεων. Εντούτοις, στις περιπτώσεις αυτές δεν προέκυψε αποκλεισμός συγγένειας, ενώ η γονικότητα επιβεβαιώθηκε και μέσω των HLA (WHLA:0,9972-0,9999). Οι αθροιστικές τιμές WaSTRs+HLA ξεπέρασαν το 0,99999999. Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ πατρικής και μητρικής μετάλλαξης/σιωπηλών αλληλίων (7:1, p=0,036).Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα και τη δύναμη της aSTR γονοτύπησης στην επίλυση περιστατικών αμφισβητούμενης πατρότητας/μητρότητας. Η μελέτη των 15-16 aSTRs αποτελεί μία ακριβή, επαναλήψιμη, υψηλής ευαισθησίας δοκιμασία, απλούστερη στην εκτέλεση και ταχύτερη από τις συμβατικές μεθόδους (HLA). Παρέχει επαρκώς τεκμηριωμένα δεδομένα για trio δοκιμασίες ελέγχου συγγένειας και είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε περιπτώσεις που το DNA της μητέρας δεν είναι διαθέσιμο, ή περιπτώσεις που ελέγχονται άτομα από την ίδια πατρική γενεαλογία. Δίνει αποδεκτά αποτελέσματα στον έλεγχο ατόμων με συγγενική σχέση μεταξύ τους. Ωστόσο, ο συνδυασμός των δύο συστημάτων παρέχει υψηλότερη πληροφόρηση και μειώνει την πιθανότητα ψευδούς αποκλεισμού λόγω aSTRs μεταλλάξεων/σιωπηλών αλληλίων, ή ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο εσφαλμένου μη αποκλεισμού, λόγω απουσίας του γενετικού προφίλ της μητέρας.