Functional studies of the neoplastic B cells In chronic lymphocytic leukemia: intrinsic and extrinsic mechanisms

Abstract

1.The histone methyltransferase EZH2 as a novel prosurvival factor in clinically aggressive chronic lymphocytic leukemia. The histone methyltransferase EZH2 induces gene repression through trimethylation of histone H3 at lysine 27 (H3K27me3). EZH2 overexpression has been reported in many types of cancer and associated with poor prognosis. Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the Western world, characterized by the progressive accumulation of small, mature B lymphocytes in blood, bone marrow and lymphatic tissues. CLL is a very heterogeneous malignancy at both clinical and biological levels. In our previous study we demonstrated that EZH2 is highly expressed in a subgroup of patients (subset #1), characterized by a stereotyped B cell receptor (BcR) with unmutated immunoglobulin heavy variable genes (U-CLL) and an aggressive disease course.Here we investigated in a larger cohort of patients the expression and functionality of EZH2 in CLL. Aggressive cases with unmutated IGHV genes (U-CLL) displayed significantly higher EZH2 expression compared to indolent CLL cases with mutated IGHV genes (M-CLL), both in mRNA and protein levels; furthermore, in U-CLL EZH2 expression was upregulated with disease progression. EZH2high cases displayed high H3K27me3 levels and increased viability suggesting that EZH2 is functional and likely confers a survival advantage to CLL cells. This argument was further supported by siRNA-mediated downmodulation of EZH2 which resulted in increased apoptosis and reduced H3K27me3 levels in EZH2high cases. Treatment of primary CLL cells with EZH2 inhibitors, namely EPZ6438, GSK343 and GSK126 induced downregulation of H3K27me3 levels leading to increased cell apoptosis.In conclusion, EZH2 is overexpressed in adverse-prognosis CLL and associated with increased cell survival. Pharmacologic inhibition of EZH2 catalytic activity promotes apoptosis, highlighting EZH2 as a novel potential therapeutic target for specific subgroups of patients with CLL. 2.Inhibition of EZH2 and immune signaling exerts synergistic anti-tumor effects in ChronicLymphocytic LeukemiaMultiple lines of evidence highlight the role of external drive in CLL pathogenesis and suggest that microenvironmental stimuli received from the CLL cells through their immune receptors (e.g. BcR, TLRs, CD40, cytokine receptors and complement receptors) play an important role in the survival and proliferation of CLL cells in vivo. Here, we explored if EZH2 expression and function could be affected by microenvironmental triggering and whether synergism may exist between EZH2 and signaling inhibitors. The study group included cases responsive to BcR stimulation. Ex vivo stimulation of primary CLL cells from these cases through the BcR, CD40 and, especially, TLR9 led to EZH2 upregulation, accompanied by elevated H3K27me3 levels and significant increase in cell viability, suggesting that EZH2 expression likely contributes to the anti-apoptotic phenotype induced by microenvironmental signals. Ex vivo exposure to Ibrutinib exerted a significantly higher pro-apoptotic effect in CLL cells from EZH2high versus EZH2low cases, further highlighting links between microenvironmental triggering and EZH2 expression and functionality. Next, we investigated whether signaling inhibition might also modulate EZH2 expression and functionality in vivo by longitudinal profiling of CLL patients under Ibrutinib treatment. EZH2 protein levels and H3K27me3 declined at +1 month under treatment. However, at later time points they returned to levels similar to the pre-treatment sample, suggesting that EZH2 expression and functionality may characterize persisting cells, retained after prolonged treatment. Ex vivo treatment of primary CLL cells and splenic B cells from Tcl1 leukemic mice (the most common murine model in CLL) by combined EZH2 and signaling inhibitors (Ibrutinib, Idelasisib) was more effective in promoting apoptosis than single inhibition. Finally, ex vivo exposure to EZH2 inhibitorsinduced apoptosis in primary CLL cells from cases with suboptimal response to signaling inhibitors, further highlighting that targeting both processes might represent a novel therapeutic strategy for CLL.

1.H υπερέκφραση της μεθυλοτρανσφεράσης των ιστονών EZH2 στη Xρόνια Λεμφοκυτταρική λευχαιμία παρέχει προστασία από απόπτωση και συνδέεται με κλινική επιθετικότητα. Η μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών ΕΖΗ2 είναιη καταλυτική υπομονάδα του κατασταλτικού συμπλόκου Polycomb 2 (PolycombRepressorComplex 2, PRC2) μέσω του οποίου καταλύει την τριμεθυλίωση της ιστόνης Η3 στο κατάλοιπο λυσίνη 27 (H3K27me3) επάγοντας αποσιώπηση γονιδίων. Η ΕΖΗ2 υπερεκφράζεται σε πλειάδα κακοηθειών, μεταξύ άλλων και κακοήθειες του λεμφικού ιστού και γενικά συσχετίζεται με δυσμενή πρόγνωση. Σε προκαταρκτική μελέτη μας δείξαμε για πρώτη φορά ότι η ΕΖΗ2 εκφράζεται στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία (ΧΛΛ), ιδίως σε περιπτώσεις που ανήκουν στο υποσύνολο #1, ομάδα ασθενών οι οποίοι χαρακτηρίζονται από δυσμενή κλινική πορεία. Στην παρούσα μελέτη επεκτείναμε την ανάλυση της έκφρασης της ΕΖΗ2 σε καλά χαρακτηρισμένη ομάδα 131 ασθενών με ΧΛΛ και διερευνήσαμε το λειτουργικό αντίκτυπό της στη συμπεριφορά των λευχαιμικών κλώνων. Η μελέτη περιλάμβανε: (i) ποσοτικοποίηση των mRNA μεταγράφων της ΕΖΗ2, (ii) προσδιορισμό της έκφρασης της ΕΖΗ2 σε επίπεδο πρωτεΐνης, (iii) μέτρηση επιπέδωντου δείκτη λειτουργίας της EZH2, H3K27me3, (iv) ανάλυση βιωσιμότητας ΧΛΛ κυττάρων με κυτταρομετρία ροής, (v) διαμόλυνση των ΧΛΛ κυττάρων με siRNA ειδικό για την EZH2 και τέλος, (vi) εφαρμογή φαρμακολογικών αναστολέων της ΕΖΗ2 σε κύτταρα ΧΛΛ. Τεκμηριώνουμε ότι η υπερέκφραση της EZH2 αποτελεί βασικό χαρακτηριστικό των κλινικά επιθετικών περιπτώσεων ΧΛΛ που φέρουν κυρίως αμετάλλακτα γονίδια IGHV, επηρεάζοντας τα επίπεδα της H3K27me3 στα λευχαιμικά κύτταρα και προσδίδοντάς τους έτσι πλεονέκτημα επιβίωσης και προστασία από απόπτωση. Στη συνέχεια, για να αποδείξουμε ότι η ΕΖΗ2 ευθύνεται για την αυξημένη βιωσιμότητα των κυττάρων, καταστείλαμε την έκφραση της ΕΖΗ2 με ειδικά siRNAs σε περιπτώσεις με ‘’υψηλή ΕΖΗ2’’και διαπιστώσαμε ότι μείωση της έκφρασης της ΕΖΗ2 επιφέρει επίσης μείωση των αντίστοιχων επιπέδων της H3K27me3, καθώς και επαγωγή απόπτωσης των κυττάρων της ΧΛΛ. Επιπλέον, δείξαμε ότι αυξημένη έκφραση της ΕΖΗ2 συσχετίζεται με ταχύτερη πρόοδο νόσου. Επίσης, παρουσιάζουμε προκλινικά δεδομένα που δείχνουν ότι η αναστολή της καταλυτικής ενεργότητας της ΕΖΗ2 με ειδικούς φαρμακολογικούς αναστολείς, όπως οι EPZ6438, GSK343 και GSK126, προάγει απόπτωση των κυττάρων της ΧΛΛ, καθώς και μείωση των επίπεδων της Η3Κ27me3, αναδεικνύοντας ένα νέο πιθανό θεραπευτικό στόχο για ασθενείς με επιθετική νόσο. 2. Συνεργική δράση των αναστολέων της άνοσης σηματοδότησης και της μεθυλοτρανσφεράσης των ιστονών EZH2 στη Xρόνια Λεμφοκυτταρική λευχαιμία: θεραπευτικές προεκτάσειςΗ ΕΖΗ2 υπερεκφράζεται σε κλινικά επιθετικές περιπτώσεις με ΧΛΛ και επάγει αυξημένη επιβίωση και προστασία από απόπτωση στα λευχαιμικά κύτταρα. Tα Β κύτταρα της ΧΛΛ λαμβάνουν σήματα επιβίωσης από το μικροπεριβάλλον μέσω πολλαπλών υποδοχέων, όπως ο Β κυτταρικός υποδοχέας (ΒΚΥ), οι υποδοχείς τύπου Toll (TLR) και ο CD40. Με βάση τα παραπάνω, στην παρούσα μελέτη εξετάσαμε εάν ερεθίσματα από το μικροπεριβάλλον μπορούν να επηρεάσουν την έκφραση της ΕΖΗ2 και κατ’ επέκταση τη βιωσιμότητα των κυττάρων της ΧΛΛ. Η ομάδα μελέτης καθορίστηκε με βάση την ικανότητα απάντησης στη διέγερση του ΒΚΥ: έτσι, επιλέχθηκαν για ανάλυση μόνο περιπτώσεις που απαντούσαν στην ενεργοποίηση του ΒΚΥ. Διαπιστώσαμε ότι ερεθίσματα του μικροπεριβάλλοντος μέσω του ΤLR9 και/ή CD40, αλλά ιδίως η διέγερση μέσω του υποδοχέα TLR9, οδηγεί σε αυξημένη έκφραση της ΕΖΗ2 και ενισχύει την επιβίωση του λευχαιμικού κλώνου. Σε αυτό το πλαίσιο, εξετάσαμε την επίδραση των αναστολέων της άνοσης σηματοδότησης στην έκφραση της ΕΖΗ2 στα ΧΛΛ κύτταρα καθώς και την πιθανή συνεργική δράση τους με αναστολείς της ΕΖΗ2. Αρχικά, μελετήσαμε εάν η θεραπεία με Ibrutinib μπορεί να επηρεάσει την έκφραση της EZH2 και τα επίπεδα της Η3K27me3 invivo. Η ομάδα μελέτης περιλάμβανε ασθενείς με ΧΛΛ οι οποίοι έλαβαν Ibrutinib ως μονοθεραπεία. Ανάλυση με ανοσοαποτύπωση western ανέδειξε μείωση των επιπέδων της πρωτεϊνικής έκφρασης της EZH2 καθώς και των επιπέδων της Η3Κ27me3 μετά από 1 μήνα θεραπείας συγκριτικά με το αντίστοιχο δείγμα πριν τη θεραπεία, ενισχύοντας τα προηγούμενα ευρήματά μας που συνδέουν τη σηματοδότηση των Β κυττάρων με την έκφραση και λειτουργία της ΕΖΗ2. Στη συνέχεια, ελέγξαμε με κυτταρομετρία ροής την επίδραση του Ibrutinib στη βιωσιμότητα των κυττάρων ex vivo σε περιπτώσεις ασθενών ΧΛΛ με υψηλά και χαμηλά επίπεδα EZH2 και διαπιστώσαμε ότι το Ibrutinib οδηγεί σε απόπτωση των ΧΛΛ κυττάρων μόνο στις περιπτώσεις με υψηλά επίπεδα ΕΖΗ2. Σε μια διαφορετική ομάδα ασθενών με ΧΛΛ οι οποίοι είχαν ελεγχθεί και βρεθεί να απαντούν σε διέγερση μέσω του TLR9 εξετάσαμε την πιθανή συνεργική δράση μεταξύ των αναστολέων της άνοσης σηματοδότησης Ibrutinib (IB) και Idelalisib (IDE) και των αναστολέων της EZH2 (GSK343, GSK126). Μετά από διέγερση με CpG (ειδικός προσδέτης για τον TLR9) επί 24 ώρες, ώστε να αυξηθεί η έκφραση της ΕΖΗ2, ακολούθησε μεμονωμένη επώαση με κάθε αναστολέα (IB, IDE, GSK343, GSK126) και συνδυαστική εφαρμογή των αναστολέων (IB/GSK343, IDE/GSK343, IB/GSK126). Μετά από 3 ημέρες καλλιέργειας αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής τα επίπεδα βιωσιμότητας και Η3Κ27me3. Η μεμονωμένη αναστολή με IB, IDE, GSK343 και GSK126 οδήγησε σε απόπτωση των ΧΛΛ κυττάρων σε σχέση με ΧΛΛ κύτταρα χωρίς έκθεση σε αναστολείς (FD≥ 1.4), ενώ η συνδυαστική αναστολή με IB/GSK343, IDE/GSK343 και IB/GSK126 ήταν πολύ πιο αποτελεσματική, εφόσον οδήγησε σε ακόμα μεγαλύτερη μείωση της βιωσιμότητας και των επιπέδων της Η3Κ27me3 σε σύγκριση με τη μεμονωμένη αναστολή (FD≥1.5, p<0.05). Στη συνέχεια απομονώσαμε Β σπληνοκύτταρα από Tcl1 λευχαιμικά ποντίκια (το καλύτερα μελετημένο μοντέλο ποντικού στη ΧΛΛ) όπου παρατηρήσαμε αυξημένη έκφραση ΕΖΗ2 σε σχέση με κύτταρα από ποντίκια μάρτυρες (Wild Type, WT), καθώς επίσης αυξημένα επίπεδα πολλαπλασιασμού συγκριτικά με τα κύτταρα της ΧΛΛ. Τα προηγούμενα ευρήματα σχετικά με τη συνεργική δράση των αναστολέων άνοσης σηματοδότησης και της EZH2 επιβεβαιώθηκαν επίσης στα Β σπληνοκύτταρα από Tcl1 λευχαιμικά ποντίκια, με εμφανή μείωση επιπέδων πολλαπλασιασμού και βιωσιμότητας μετά από συνδυαστική δράση των αναστολέων συγκριτικά με τη μεμονωμένη επώαση. Τέλος, δείξαμε ότι η εφαρμογή φαρμακολογικών αναστολέων της EZH2 (GSK343 και GSK126) επάγει απόπτωση και μείωση στα επίπεδα H3K27me3 σε κύτταρα από περιπτώσεις ΧΛΛ που εμφάνισαν ανθεκτικότητα ή μειωμένη απόκριση στη θεραπεία με αναστολείς σηματοδότησης (IΒ ή IDE), παρέχοντας έτσι νέα δεδομένα για το σχεδιασμό και την παρακολούθηση των ασθενών με εξατομικευμένες θεραπευτικές στρατηγικές προσεγγίσεις.Συμπερασματικά, παρουσιάζουμε για πρώτη φορά ισχυρές ex vivo ενδείξεις ότι ο συνδυασμός φαρμακολογικών αναστολέων της άνοσης σηματοδότησης και αναστολέων της EZH2 έχει συνεργική δράση στη ΧΛΛ, υποδεικνύοντας μια εναλλακτική θεραπευτική στρατηγική για κλινικά επιθετικές περιπτώσεις ΧΛΛ.