Μελέτη των μεταβολών της έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με το μεταβολισμό και την δράση χημειοθεραπευτικών στον πρωτοπαθή όγκο και στους επιχώριους και μεσοθωρακικούς διηθημένους λεμφαδένες σε χειρουργήσιμο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ΜΜΚΚΠ)

Abstract

Differences in gene expression levels between the primary tumors (PTs) and matched regional lymph nodal metastases (LNs) in patients with totally excised non- small cell lung cancer (NSCLC) were explored. Microdissected formalin- fixed paraffin- embedded (FFPE) samples from (PT) and their matched infiltrated LNs, from 239 patients [183 (with matched PT and LNs samples)- case& 56 PT only samples- control cohorts ] were analyzed for BRCA1, ERCC1, RAP80, PKM2, RRM1, RRM2, TS, TSP1 and TXR1 mRNA expression by quantitative real- time polymerase- chain reaction (PCR). Moderately positive correlation between the expression of each gene in the PT and the matched LNs was observed. Concordance rates between the PT and the LNs were: BRCA1 (67.7%), ERCC1 (68.4%), PKM2 (63.4%), RAP80 (68.8%), RRM1 (70.9%), RRM2 (69%), TS (72.9%), TSP1 (69.8%), TXR1 (63.7%). Expression levels and their differences were correlated with Relapse- Free Survival (RFS) and Overall Survival (OS). High BRCA1 PT in patients with squamous histology was associated with increased OS (p= 0.036). High TSP1 PT levels were shown to be the only independent prognostic factor for OS and RFS (p= 0.023 and p=0.007). PKM2 low levels in both PT and matched LNs were associated with better OS irrespective of the underlying histology (p= 0.031). RRM1 discordant levels between PT and matched LNs were associated with worse OS in squamous tumors (p= 0.019) compared to patients with both low expression in PT and LN.TXR1 high levels in both PT and matched LNs were associated with better OS in patients with squamous tumors (p= 0.007).These findings indicate that there is different gene expression between PT and matched LNs which may affect the outcome in early NSCLC and therefore PT’s molecular biology should not be the sole determinant for prognostication.

Το πρωτοπαθές καρκίνωμα του πνεύμονα αποτελεί τη συχνότερη αιτία θανάτου από νεοπλασία παγκοσμίως (1). Το μη-μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα, (ΜΜΚΠ) αποτελεί το 85% των καρκινωμάτων του πνεύμονα, με κυριότερους ιστολογικούς υπότυπους το αδενοκαρκίνωμα (ADC, ~48%), το ακανθοκυτταρικό (SCC, ~28%) το μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα (LCC, ~24%), το μεικτό και τέλος, το αδιαφοροποίητο καρκίνωμα. Παρά τις προσπάθειες για πρώιμη διάγνωση η πλειονότητα των ασθενών με ΜΜΚΠ διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο κλινικό στάδιο και έχει φτωχή πρόγνωση. Αν και γενικά συγκαταλέγεται στους συμπαγείς όγκους με μέτρια χημειοευαισθησία και πτωχή πρόγνωση, ο ΜΜΚΠ χαρακτηρίζεται από ετερογένεια στη βιολογική του συμπεριφορά. Δεδομένου ότι στα προχωρημένα στάδια της νόσου ο ρόλος της συστηματικής θεραπείας είναι μόνο ανακουφιστικός, τα επιδιωκόμενα οφέλη (παράταση της επιβίωσης, έλεγχος των συμπτωμάτων και βελτίωση της ποιότητας ζωής) πρέπει να εξισορροπούν την αναμενόμενη τοξικότητα.Αν και τα χημειοθεραπευτικά σχήματα με βάση την πλατίνα έχουν καθιερωθεί στη θεραπεία πρώτης γραμμής, οι μη-πλατινούχοι συνδυασμοί, όπως της γεμσιταβίνης (gemcitabine) με τις ταξάνες, αναγνωρίζονται ως εναλλακτική επιλογή με παρόμοια αποτελεσματικότητα και ευνοϊκότερο τοξικό προφίλ. Η ανταπόκριση του ΜΜΚΠ στα σχήματα αυτά φαίνεται να συσχετίζεται με την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ή/και στο μηχανισμό δράσης, σύμφωνα με τα δεδομένα προκλινικών αναδρομικών κλινικών μελετών αλλά και προοπτικών κλινικών δοκιμών. Είναι επομένως, επιτακτική η ανεύρεση αξιόπιστων προβλεπτικών και προγνωστικών μοριακών δεικτών που να επιτρέπουν την εξατομίκευση της θεραπείας στον ΜΜΚΠ, προς όφελος των ασθενών, με παράλληλη μείωση του οικονομικού κόστους. Ένα βασικό ερώτημα αποτελεί αν η γονιδιακή έκφραση μεταβάλλεται ανάλογα με το αν προέρχεται από τον πρωτοπαθή όγκο ή μια μεταστατική εστία. Το ερώτημα αυτό είναι δύσκολο να απαντηθεί αφού θα απαιτούσε τη διενέργεια βιοψιών σε ασθενείς με μεταστατική νόσο χωρίς αναμενόμενο όφελος για αυτούς. Εναλλακτικά μπορεί να απαντηθεί συγκρίνοντας την γονιδιακή έκφραση μεταξύ του πρωτοπαθούς όγκου και των επιχώριων ή μεσοθωρακικών λεμφαδένων κατά το χειρουργείο εκτομής του όγκου που εμφανίζουν διήθηση.Σκοπός της μελέτης:Ν’ αναζητήσει μεταβολές της έκφραση, στον πρωτοπαθή όγκο ασθενών και τους επιχώριους και μεσοθωρακικούς λεμφαδένες, γονιδίων που εμπλέκονται στο μεταβολισμό ή/και τη δράση χημειοθεραπευτικών που χορηγούνται στο ΜΜΚΠ και να μελετήσει την προγνωστική και προβλεπτική αξία της γονιδιακής έκφρασης στον πρωτοπαθή όγκο και τους διηθημένους λεμφαδένες (επίδραση στην επιβίωση και το διάστημα ελεύθερο νόσου)Υλικό και μέθοδοι μελέτης:Η μελέτη διεξήχθη στο Εργαστήριο Βιολογίας του Καρκίνου του Ιατρικού τμήματος του Πανεπιστημίου Κρήτης σε αρχειακό υλικό που έχει ήδη αρχειοθετηθεί στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του ΠΑ.Γ.Ν.Η., και σε συνδυασμό με τα κλινικά δεδομένα της Παθολογικής Ογκολογικής Κλινικής (Π.ΟΓΚ.) του Νοσοκομείου. Η έρευνα διενεργήθηκε σε κύβους παραφίνης ασθενών που έχουν υποβληθεί σε θεραπευτική χειρουργική επέμβαση για ΜΜΚΠ σταδίων Ι-ΙΙΙΑ με την μέθοδο της qRT-PCR για την ανάλυση της έκφρασης των γονιδίων που εμπλέκονται με αντίσταση στις κύριες κατηγορίες χημειοθεραπευτικών: a.Ταξάνες: TS, TXR1, TSP1, BRCA1 b.Ανάλογα της Πλατίνας: ERCC1, BRCA1, BRCA2, RAP80, PKM2, c. Gemcitabine: RRM1, RRM2Η ανάλυση έγινε σε καρκινικά κύτταρα μετά την απομόνωση τους από την ιστό με τη χρήση piezo-electric microdissector (Eppendorf). Η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης έγινε με τη μέθοδο της ΔΔCT, με τη χρήση ρυθμιστών εμπορικού RNA (από πνεύμονα και ήπαρ) καθώς και RNA κυτταρικής σειράς εμποτισμένης με φορμόλη και εγκλωβισμένη σε παραφίνη, και την έκφραση των γονιδίων β-ACTIN και PGK σαν εσωτερικό πρότυπο.Στατιστική ανάλυση:Ο υπολογισμός της έκφρασης των υπό μελέτη γονιδίων έγινε με βάση τη μέση τιμή .Fisher’s exact test χρησιμοποιήθηκε για τη μελέτη συγκρίσεων σε πίνακες 2 επί 2 ενώ το χ2 test για μελέτη συγκρίσεων σε πίνακες μεγαλύτερους από 2 επί 2. Η συσχέτιση της συν-έκφρασης των διαφόρων γονιδίων έγινε με βάση το Spearman correlation coefficients test. Mann-Whitney t-test για τη μελέτη συσχέτισης μεταξύ συνεχών μεταβλητών (π.χ. γονιδιακή έκφραση) και κατηγορικών μεταβλητών (π.χ. φύλλο, αρχικό στάδιο διάγνωσης). Logistic regression ανάλυση έγινε για την ανάδειξη στατιστικώς σημαντικών παραγόντων στην μονοπαραγοντική ανάλυση. Πολυπαραγοντική ανάλυση με Cox’s proportional hazards πραγματοποιήθηκε για την ανάδειξη της σημαντικότητας των στατιστικώς σημαντικών παραγόντων στη μονοπαραγοντική ανάλυση σε σχέση με την ανταπόκριση, το διάστημα έως την υποτροπή και την ολική επιβίωση. Το διάστημα ελεύθερο νόσου (έως την υποτροπή) και η συνολική επιβίωση των ασθενών εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier. Για όλα τα test το επίπεδο σημαντικότητας ορίζεται για p=0.05.Αποτελέσματα:Δείγματα όγκου και κλινικά δεδομένα από 239 ασθενείς με διαγνωσθέντα ΜΜΚΠ κατά τη διάρκεια των τελευταίων 20 ετών αναλύθηκαν (183 δείγματα πρωτοπαθούς όγκου καθώς και αντίστοιχα δείγματα διηθημένων λεμφαδένων αντιπροσωπεύοντας την πειραματική ομάδα και επιπροσθέτως 56 δείγματα πρωτοπαθούς όγκου χωρίς λεμφαδενική διήθηση αντιπροσωπεύοντας την ομάδα ελέγχου, αντίστοιχα).Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 64 ετών και η μέσος χρόνος παρακολούθησης ήταν τα 8 έτη. Η υψηλή έκφραση BRCA1 στον πρωτοπαθή όγκο σε ασθενείς με πλακώδες καρκίνωμα και η χαμηλή έκφραση TXR1 επίσης στον πρωτοπαθή όγκο σε ασθενείς με μη-πλακώδες καρκίνωμα συσχετίστηκε με αυξημένη ολική επιβίωση (OS) (p = 0,036 & p = 0,04, αντίστοιχα). Η υψηλή έκφραση TSP1 στον πρωτοπαθή όγκο ήταν ο μόνος ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την ολική επιβίωση αλλά και για το διάστημα ελεύθερο της νόσου (OS / RFS) (p = 0,023 / p = 0,007 αντίστοιχα). Παρατηρήθηκε μη γραμμική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης κάθε γονιδίου στον πρωτοπαθή όγκο και στους τοπικοπεριοχικούς λεμφαδένες. Η χαμηλή έκφραση του PKM2 τόσο σε πρωτοπαθή όγκο όσο και σε τοπικοπεριοχικούς λεμφαδένες συσχετίστηκε με αυξημένη επιβίωση ανεξάρτητα από την υποκείμενη ιστολογία (p = 0,031). Διαφορετική έκφραση του RRM1 σε πρωτοπαθή όγκο και τους τοπικοπεριοχικούς λεμφαδένες συσχετίστηκαν με μειωμένη επιβίωση σε πλακώδεις όγκους (p = 0,019) σε σύγκριση με ασθενείς με χαμηλή έκφραση σε πρωτοπαθή όγκο και σε τοπικοπεριοχικούς λεμφαδένες. Η υψηλή έκφραση του TXR1 τόσο σε πρωτοπαθή όγκο όσο και στους λεμφαδένες σχετίζονται με αυξημένη επιβίωση (p = 0.007) αλλά και παρατεταμένο διάστημα ελεύθερο της νόσου (p = 0.004) σε πλακώδη ιστολογία του όγκου.Συμπέρασμα:Η πολυμορφία στις γονιδιακές εκφράσεις μεταξύ πρωτοπαθούς όγκου και διηθημένων τοπικοπεριοχικών λεμφαδένων μπορεί να επηρεάσει την έκβαση και επιβίωση των ασθενών με χειρουργήσιμο ΜΜΚΠ. Η βιολογία του πρωτοπαθούς όγκου κατά συνέπεια δεν θα πρέπει να θεωρείται ως ο μόνος καθοριστικός προγνωστικός παράγοντας για την έκβαση της νόσου.