Ανάπτυξη και επικύρωση αναλυτικών μεθοδολογιών προσδιορισμού αντικαταθλιπτικών και αντιψυχωσικών φαρμάκων σε νεκροτομικό υλικό και βιολογικά υγρά ασθενών

Abstract

The antipsychotic and antidepressant drugs are two classes of prescribed medication with central nervous system action. They are prescribed for the treatment of different psychotic disorders, primarily schizophrenia and depression. These classes of xenobiotic compounds are of significant interest in the fields of Clinical and Forensic Toxicology. The determination of APs and ADs in clinical samples from psychiatric patients could contribute to the monitoring of therapeutic drug levels. Uncertain drug adherence, suboptimal tolerability, non-response at therapeutic doses, or pharmacokinetic drug-drug interactions are typical situations revealed during therapeutic drug monitoring. Moreover, antipsychotics and antidepressants can cause severe side effects to the psychiatric patient, even death. Furthermore, they are accused for significant increase in suicidal ideation and subsequent suicidal attempts. In addition, poisonings due to psychiatric drugs can frequently occur worldwide especially in countries with developed economies and health systems. Poisonings could be the result either of suicide attempts or accidental ingestions. Therefore, APs and ADs are included among the drugs routinely screened for during postmortem toxicological analyses. For all the aforementioned reasons, the development of analytical methods for the qualitative and quantitative determination of these drugs in clinical and postmortem specimens is very significant.In this contribution, eight antipsychotic drugs (olanzapine, haloperidol, amisulpride, risperidone, paliperidone, clozapine-with metabolite N-desmethylclozapine-, quetiapine and aripiprazole), nine antidepressants (mirtazapine, bupropion, venlafaxine, citalopram, (with metabolite N-desmethylcitalopram), paroxetine, duloxetine, agomelatine, sertraline (with metabolite N-desmethylsertraline) and clomipramine were included as target analytes for new method development.Initially, different extraction procedures (LLE, SPE), for the isolation of analytes from biological samples (plasma, serum, whole blood, urine and liver tissue), were optimized. The extracts were analyzed further either with gas (GC) or with liquid chromatography (LC). The proposed analytical protocols were validated by applying international guidelines. The validation criteria were the following: selectivity, specificity linearity, accuracy, precision, detectability and stability.More specifically, a new SPE-GC-MS method was developed for the quantification of nine analytes, (antipsychotics: haloperidol, olanzapine, clozapine and antidepressants: mirtazapine, bupropion, venlafaxine, citalopram, sertraline clomipramine), with high selectivity, accuracy, precision and relative low cost and rapid quantification.In addition, a new SPE(LLE)-UHPLC-UV/DAD method was developed for the quantification of 19 analytes (antipsychotics: olanzapine, amisulpride, risperidone, paliperidone, clozapine, Ν-desmethylclozapine, quetiapine, aripiprazole and antidepressants: mirtazapine, bupropion, venlafaxine, citalopram, N-desmethylcitalopram, paroxetine, duloxetine, agomelatine, sertraline, N-desmethylsertraline, clomipramine); the LC method was validated with the same analytical criteria as the GC method.It is worth mentioning, that the SPE(LLE)-UHPLC-UV/DAD method is the only one far which ensures the quantitative determination of agomelatine (one of the most modern antidepressants) in postmortem material, to the best of our knowledge.The developed analytical methods were successfully applied for the determination of the selected antipsychotics and antidepressants in clinical samples from psychiatric patients, under antipsychotic medication, as well as, in postmortem specimens, sampled during autopsy for routine death investigation processes.The analysis of clinical samples revealed, that relatively high frequencies of samples had concentrations of antipsychotics lower or higher than respective therapeutic ranges. More specifically, the mean concentrations of aripiprazole, quetiapine and risperidone were lower than the lower values of the respective therapeutic range levels. Furthermore, the concentrations of clozapine in some samples were higher than the higher value of the respective therapeutic window. These findings indicate that the measurement of antipsychotics level can be a useful tool for the optimization of psychopharmacotherapy and a significant contributor to the individualized medicine.Last but not least, the proposed methodologies were proved suitable for postmortem toxicological investigations and confirmed the importance of accurate and sensitive analytical methods for the determination of APs and ADs in biological specimens, order to contribute the forensic investigation of postmortem cases.

Τα αντιψυχωσικά και τα αντικαταθλιπτικά φάρμακα δρουν στο κεντρικό νευρικό σύστημα και χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία της σχιζοφρένειας, της κατάθλιψης και άλλων ψυχιατρικών διαταραχών. Αποτελούν δύο μεγάλες κατηγορίες ξενοβιοτικών ενώσεων που ο προσδιορισμός τους παρουσιάζει πολύ μεγάλο ενδιαφέρον, τόσο για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς λόγους που εμπίπτουν στο αντικείμενο της Κλινικής Τοξικολογίας, όσο και κατά την τοξικολογική διερεύνηση περιστατικών ιατροδικαστικού ενδιαφέροντος, που εμπίπτουν στο αντικείμενο της Δικαστικής Τοξικολογίας. Ο προσδιορισμός αντιψυχωσικών και αντικαταθλιπτικών φαρμάκων σε βιολογικά υλικά που λαμβάνονται από ψυχιατρικά ασθενείς, μπορεί να κριθεί απαραίτητος κατά τη διερεύνηση περιστατικών δηλητηριάσεων, ή/και για τη συστηματική, ή ακόμη και τη σποραδική, παρακολούθηση των επιπέδων τους στο πλάσμα του ασθενούς. Σε κλινικά περιστατικά ο προσδιορισμός των παραπάνω φαρμάκων είναι χρήσιμος όταν υπάρχει υποψία, μερικής ή ολικής, μη συμμόρφωσης του πάσχοντος στη θεραπευτική αγωγή και μη βελτίωση της κλινικής εικόνας. Τα αντιψυχωσικά και αντικαταθλιπτικά φάρμακα παρουσιάζουν σοβαρές παρενέργειες που μπορούν να οδηγήσουν ακόμη και στον θάνατο. Ακόμη, η λήψη τέτοιων φαρμάκων συνδέεται συχνά με αύξηση των αυτοκτονικών τάσεων του ασθενή και με περιστατικά αυτοκτονίας. Επιπλέον, στις περισσότερες χώρες και κυρίως σε αυτές με ανεπτυγμένες οικονομίες και συστήματα υγείας, η δηλητηρίαση από ψυχιατρικά φάρμακα είναι ένα αρκετά συχνό φαινόμενο, είτε οφείλεται σε απόπειρες αυτοκτονίας είτε σε ατυχήματα. Αυτό έχει σαν αποτέλεσμα τα APs και ADs να συμπεριλαμβάνονται συνήθως μεταξύ των φαρμάκων που αναζητούνται κατά τη διενέργεια τοξικολογικής ανάλυσης, για να διαπιστωθεί η πιθανή συνεισφορά τους στην αιτία και στον μηχανισμό θανάτου. Για όλους τους παραπάνω λόγους καθίσταται αναγκαία και σημαντική η ανάπτυξη αναλυτικών μεθόδων ποσοτικού προσδιορισμού των αντιψυχωσικών και των αντικαταθλιπτικών φαρμάκων σε κλινικά δείγματα καθώς και σε νεκροτομικό υλικό.Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν οκτώ αντιψυχωσικά φάρμακα: η αλοπεριδόλη, η ολανζαπίνη, η αμισουλπρίδη, η ρισπεριδόνη, η παλιπεριδόνη, η κλοζαπίνη η κουετιαπίνη, η αριπιπραζόλη και ο μεταβολίτης της κλοζαπίνης, Ν-desmethylclozapine. Από την κατηγορία των αντικαταθλιπτικών μελετήθηκαν εννέα φάρμακα: η μιρταζαπίνη, η βουπροπιόνη, η βενλαφαξίνη, η σιταλοπράμη, η παροξετίνη, η αγομελατίνη, η σερτραλίνη, η κλομιπραμίνη, η ντουλοξετίνη και οι μεταβολίτες N-desmethylcitalopram και N-desmethylsertraline.Για τον προσδιορισμό των παραπάνω αναλυτών, αρχικά πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση των μεθοδολογιών εκχύλισής τους (LLE, SPE) από βιολογικά υλικά (πλάσμα, ορός, ολικό αίμα, ούρα και ιστός ήπατος) και χρωματογραφική ανάλυση των εκχυλισμάτων με αέρια (GC) και υγρή χρωματογραφία (LC). Για την επαλήθευση της καταλληλότητας και της απόδοσης των αναλυτικών μεθόδων που αναπτύχθηκαν για τον προσδιορισμό των αντιψυχωσικών και αντικαταθλιπτικών φαρμάκων σε βιολογικά υποστρώματα, πραγματοποιήθηκε επικύρωση αυτών με χαρακτηριστικά ποιότητας την εκλεκτικότητα, την γραμμικότητα, την ακρίβεια, την πιστότητα, την ανιχνευσιμότητα και την σταθερότητα.Συγκεκριμένα, έγινε ανάπτυξη και επικύρωση μεθοδολογίας SPE-GC-MS που εξασφάλιζε τον προσδιορισμό εννέα αναλυτών (τα αντιψυχωσικά: αλοπεριδόλη, ολανζαπίνη, κλοζαπίνη και τα αντικαταθλιπτικά: μιρταζαπίνη, βουπροπιόνη, βενλαφαξίνη, σιταλοπράμη, σερτραλίνη, κλομιπραμίνη), με μεγάλη εκλεκτικότητα, ικανοποιητική ακρίβεια, πιστότητα, χαμηλό κόστος και σχετικά ταχεία ανάλυση. Ακόμη, αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε μεθοδολογία SPE(LLE)-UHPLC-UV/DAD που εξασφάλιζε τον προσδιορισμό 19 αναλυτών (τα αντιψυχωσικά: ολανζαπίνη, αμισουλπρίδη, ρισπεριδόνη, παλιπεριδόνη, κλοζαπίνη, Ν-desmethylclozapine, κουετιαπίνη και αριπιπραζόλη, και τα αντικαταθλιπτικά: μιρταζαπίνη, βουπροπιόνη, βενλαφαξίνη, σιταλοπράμη, N-desmethylcitalopram, παροξετίνη, ντουλοξετίνη, αγομελατίνη, σερτραλίνη, N-desmethylsertraline, κλομιπραμίνη), με μεγάλη εκλεκτικότητα, ικανοποιητικά ποσοστά ανάκτησης, πιστότητα, και χαμηλό κόστος.Η μεθοδολογία SPE(LLE)-UHPLC-UV/DAD επιτρέπει τον προσδιορισμό της αγομελατίνης, του πλέον σύγχρονου αντικαταθλιπτικού φαρμάκου, ενώ αποτελεί τη μοναδική προς το παρόν μέθοδο που εξασφαλίζει τον προσδιορισμό της σε νεκροτομικό υλικό.Οι αναπτυχθείσες μεθοδολογίες εφαρμόστηκαν με επιτυχία σε τοξικολογικές αναλύσεις ρουτίνας για την ανάλυση βιολογικών δειγμάτων είτε από ψυχιατρικούς ασθενείς για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς λόγους, είτε σε νεκροτομικό υλικό κατά τη διερεύνηση περιστατικών ιατροδικαστικού ενδιαφέροντος.Κατά την ανάλυση των κλινικών δειγμάτων από ψυχιατρικούς ασθενείς παρατηρήθηκαν σε αρκετές περιπτώσεις, αποκλίσεις των προσδιοριζόμενων συγκεντρώσεων των αντιψυχωσικών από τα αντίστοιχα θεραπευτικά επίπεδα. Συγκεκριμένα, η μέση τιμή των μετρούμενων συγκεντρώσεων αριπιπραζόλης, κουετιαπίνης και ρισπεριδόνης ήταν μικρότερη από τη χαμηλότερη μέση τιμή των αντίστοιχων θεραπευτικών επίπεδων. Ακόμη, σε μικρό αριθμό δειγμάτων μετρήθηκαν συγκεντρώσεις υψηλότερες από τις αντίστοιχες θεραπευτικές, κυρίως για την κλοζαπίνη. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν τη σπουδαιότητα της συστηματικής ή σποραδικής παρακολούθησης των επιπέδων αντιψυχωσικών στο πλάσμα των ψυχιατρικά ασθενών για τη βελτίωση της ψυχοφαρμακευτικής αγωγής από τον θεράποντα ιατρό, πρακτική που συμβάλλει στην κατεύθυνση της εξατομικευμένης φαρμακολογικής θεραπείας για κάθε ασθενή.Η εφαρμογή των μεθόδων στην τοξικολογική ανάλυση νεκροτομικού υλικού επιβεβαίωσε την αναγκαιότητα αξιόπιστων και ευαίσθητων αναλυτικών μεθοδολογιών προσδιορισμού των APs και ADs, προκειμένου να διαπιστωθεί η πιθανή συμμετοχή τους στην αιτία και στον μηχανισμό θανάτου.