Οι πρωτεΐνες Chk1 και Src εμποδίζουν το σπάσιμο γεφυρών χρωματίνης στην κυτταροκίνηση

Abstract

Chromatin bridges are DNA strings of incompletely segregated chromatin which connect the daughter nuclei during cytokinesis. If unresolved, chromatin bridges can be fragmented during furrow ingression in cytokinesis, leading to genetic instability. The presence of chromatin bridges activates the abscission checkpoint which in turn delays the final cut of the cytoplasm, thus protecting from DNA bridge breakage. Furthermore, actin-rich structures known as actin patches, are formed at the base of the chromatin bridge. It has been suggested that under normal conditions, the actin patches stabilize the intercellular canal until the DNA bridge is resolved. Though, how actin patches are formed remains largely enigmatic. The nonreceptor tyrosine kinase Src, has been implicated in the rearrangement of actin cytoskeleton. In the present study, we have shown that in human cells, Src inhibition leads to increased chromatin bridge breakage and elevated frequency of cells exhibiting micronuclei. However, DNA bridge breakage in Chk1- or Src-deficient cells correlates with reduced actin patches at the bases of chromatin bridges and is not caused by abscission. Activated Src is localized to the actin patches at the bases of DNA bridges during cytokinesis. Additionally, Chk1 downregulation results in reduced Src activity, loss of actin patches and increased DNA bridge breakage. Furthermore, we found that Chk1 phosphorylates Src at a newly identified site, Serine 51, and that phosphorylation is required to fully induce Src kinase activity. Phosphorylated Src at Serine 51 is localized at the bases of DNA bridges, at the cellular membrane and the nucleus. Mutation of Serine 51 to the non-phosphorylatable aminoacid Alanine, leads to reduced actin patches and increased DNA chromatin breakage, whereas expression of a phosphomimicking Src-S51D protein rescues actin patches and prevents chromatin breakage in Chk1-deficient cells. Based on these results, we suggest a novel mechanism required for stabilization of DNA bridges during cytokinesis, which involves Chk1- and Src- dependent formation of actin patches at the bases of chromatin bridges.

Οι γέφυρες χρωματίνης είναι νήματα DNA τα οποία ενώνουν τους θυγατρικούς πυρήνες κατά το τέλος της κυτταροκίνησης και, εάν δεν επιλυθούν, μπορούν να σπάσουν προκαλώντας χρωμοσωμική αστάθεια. Παρουσία γεφυρών χρωματίνης ενεργοποιείται το abscission checkpoint το οποίο καθυστερεί το τελικό κόψιμο του κυτταροπλάσματος, για να μη σπάσουν οι γέφυρες χρωματίνης. Ακόμη, εκατέρωθεν των χρωματινικών γεφυρών σχηματίζονται δομές ακτίνης (actin patches), οι οποίες στα φυσιολογικά κύτταρα σταθεροποιούν τις γέφυρες DNA έως ότου αυτές επιλυθούν. Ωστόσο, ο μηχανισμός δημιουργίας των actin patches δεν έχει ακόμα βρεθεί. Η πρωτεϊνική κινάση τυροσίνης Src, συμμετέχει στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι αναστολή της Src σε κύτταρα ανθρώπου οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού των σπασμένων γεφυρών DNA στην κυτταροκίνηση και αύξηση του ποσοστού των κυττάρων με μικροπυρήνες. Ωστόσο, το σπάσιμο των γεφυρών DNA σε κύτταρα χωρίς λειτουργική Chk1 ή Src συσχετίζεται με απώλεια των actin patches στις βάσεις των γεφυρών DNA και όχι με δυσλειτουργία του abscission checkpoint. Η ενεργοποιημένη πρωτεΐνη Src εντοπίζεται στα actin patches, στις βάσεις των γεφυρών DNA στην κυτταροκίνηση. Επίσης, μείωση της κινάσης Chk1 οδηγεί σε μείωση της ενεργότητας της πρωτεΐνης Src, απώλεια των actin patches και αύξηση του ποσοστού των σπασμένων γεφυρών DNA στην κυτταροκίνηση. Ακόμη, δείξαμε ότι η Chk1 φωσφορυλιώνει την πρωτεΐνη Src σε μία νέα θέση, τη Σερίνη 51 και ότι η φωσφορυλιωμένη Src στη Σερίνη 51 εντοπίζεται στις βάσεις των γεφυρών DNA, την κυτταρική μεμβράνη και τον πυρήνα. Η φωσφορυλίωση της Src στη Σερίνη 51 απαιτείται για πλήρη ενεργοποίηση της Src. Έκφραση της μεταλλαγμένης Src S51A, στην οποία η Σερίνη 51 έχει μεταλλαχθεί σε Αλανίνη ώστε η θέση αυτή να μη φωσφορυλιώνεται in vivo, οδηγεί σε μείωση του ποσοστού των γεφυρών DNA με actin patches και αύξηση του ποσοστού των σπασμένων γεφυρών DNA. Αντίθετα, έκφραση της μεταλλαγμένης Src S51D, όπου η Σερίνη 51 έχει μεταλλαχθεί σε Ασπαραγινικό οξύ ώστε η θέση αυτή να μιμείται συνεχώς την φωσφορυλίωση, προστατεύει την δημιουργία των actin patches και εμποδίζει το σπάσιμο των γεφυρών DNA σε κύτταρα με μειωμένη έκφραση των Chk1 και Src πρωτεϊνών. Με βάση τα δεδομένα αυτά, προτείνουμε ένα νέο μηχανισμό σταθεροποίησης των γέφυρων DNA κατά την κυτταροκίνηση, μέσω διατήρησης των actin patches από τις πρωτείνες Chk1 και Src.