Επιδημιολογική μελέτη και διερεύνηση πλασμιδιακών AmpC β-λακταμασών και καρβαπενεμασών στα εντεροβακτηριοειδή στην ελληνική επικράτεια

Abstract

The present study has been focused on two main objectives on the one hand the detection andcharacterization of plasmid-mediated AmpC β-lactamases in Enterobacteriaceae, along withan evaluation of the effectiveness of various inhibitors in their detection and an assessment ofa modified CLSI-ESBL test and on the other hand the investigation of novel carbapenemasegenes which have recently been introduced to the Greek region.A total of 105 Enterobacteriaceae isolates (K.pneumoniae, E.coli, K.oxytoca, P.mirabilis)collected over a 9 year period from 2004 to 2012, exhibiting reduced susceptibility orresistance either to cefoxitin (FOX) and/or cefotetan (CTT) along with reduced susceptibility or resistance to at least one extended spectrum cephalosporin were further investigated for thepresence of plasmid AmpC β-lactamases. Plasmid-mediated AmpCs, ESBLs and the VIMtypecarbapenemases were sought by PCR amplification and subjected to direct sequencing.Susceptibility testing was performed with disk diffusion and ertapenem MICs were evaluatedwith the Etest method. Clonal relationship was investigated by either enterobacterial repetitiveintergenic consensus PCR (ERIC-PCR) or repetitive sequence based PCR (REP-PCR). FourAmpC inhibitors, cloxacillin (CLOX), phenyl-boronic acid (PBA), 3-acetyl-phenyl-boronic acid(APA) and 3-amino-phenyl-boronic (APBA) acid were evaluated, the latter in two finalconcentrations (300 and 600 μg/disk) with FOX, CTT, ceftazidime (CAZ) and cefotaxime (CTX)as substrates. Finally a modified CLSI ESBL test with the use of the aforementioned inhibitors andCTX and CAZ was evaluated.Altogether 59 isolates harbored plasmid-mediated AmpCs, with 35 also co-producing ESBLs.The MOX-2 β-lactamase was identified with the highest frequency followed by the CMY-2enzyme. CMY-4, CMY-13 and CMY-31 were also detected along with three novel to theregion enzymes, DHA-1 and two new AmpCs a CMY-4-like and a MIR-2-like. All P.mirabilisbelonged to one clonal type, K.oxytoca isolates presented two distinct clonal types whileK.pneumoniae and E.coli isolates presented 8 and 11 clonal types respectively.FOX resistance was found to be a discriminating parameter performing better than CTT as aninitial screening tool. In regards to the confirmatory phenotypic AmpC disk assay, FOX incombination with APBA produced the best results, successfully identifying 57/59 isolates. Theproposed modified CLSI ESBL test provided a significantly better overall performance whenperformed with CLOX (sensitivity 91,4% and specificity 75%), PBA (100%, 75%) and APBA(97,1%, 79,1%) in comparison to the standard CLSI ESBL test (85,7%, 58,3%). APA as an inhibitor failed to enhance the modified CLSI ESBL test exhibiting a suboptimal sensitivity of54,3%. Between January 2010 and June 2013, 132 non-repetitive carbapenem-resistantEnterobacteriaceae isolates, which gave positive the modified Hodge test (ΜΗΤ) and werephenotypically suspected of metallo-β-lactamase production (MBL), were recovered frompatients hospitalized in Ioannina University Hospital. Molecular testing verified the presencein 78 K. pneumoniae isolates, collected from 71 patients, of the blaNDM-1 gene. The blaCTX-M-15,blaOXA-1 and blaTEM-1 genes were also present in most isolates. The blaNDM-1 gene was locatedon an IncFII type plasmid, of c. 95kb, flanked upstream by a non-truncated ISAba125 elementand downstream by the bleMBL gene. Carbapenem resistance was transferable at a very low rateof ~ 1,3x10-7. Genotyping clustered all K. pneumoniae isolates into a single clonal type withone subtype and MLST assigned them to sequence type ST11. Two outbreaks were noted, thefirst between November-December 2011 involving four patients and the second initiated inMay 2012 and ongoing, involving the remaining patients. All but two cases were characterizedas hospital-acquired. No links to immigration or travel history to endemic areas wereestablished.From December 2011-March 2012, 13 ertapenem-resistant K. pneumoniae isolates, with apositive MHT, and negative phenotypic screening tests for MBL and KPC production, wererecovered from nine patients. All isolates harboured the blaOXA-48 gene along with blaCTX-M-15and blaOXA-1 genes. The blaOXA-48 gene was located on a self-transferable IncL/M-type plasmidof c. 62 kb, which harboured no other resistance genes. IS1999 was located upstream ofblaOXA-48 gene. Genetic disruptions of the OmpK35 and OmpK36 genes associated withpermeability defects were not detected. The isolates belonged to a unique PFGE clone andMLST assigned them to sequence type ST11. All cases were characterized as hospitalacquiredand none of them was linked to immigration or had a history of travel in endemicareas.Over a period of approximately 2,5 years initiated in 2010, three K.pneumoniae isolates were retrieved form urine samples of a single female patient, of which the first two with an intervalof 41 days, exhibiting resistance to cephamycins and extended spectrum cephalosporins, withpositive screening tests for AmpC β-lactamase production and a negative modified CLSIESBLtest. The initial two isolates exhibited carbapenem resistance, gave a positive ΜΗΤ andnegative screening tests for class A and B carbapenemase production.All isolates harbored the blaOXA-1 and blaDHA-1 genes and additionally the first two carried theblaOXA-162 gene. IS1999 was located upstream of blaOXA-162 gene. Genetic disruptions of theOmpK35 and OmpK36 genes associated with ertapenem resistance were not detected. Plasmidprofiling indicated the presence of three plasmids of ~140kb, ~62kb and 2kb in the first twowhile the latter lacked 62kb plasmid. Conjugation experiments failed to transfer β-lactamresistance. All K.pneumoniae belonged to a unique PFGE clone and MLST assigned them tosequence type ST11.

Η παρούσα διατριβή περιστρέφεται γύρω από δύο κεντρικούς άξονες, αφενός την καταγραφή και διερεύνηση πλασμιδιακών AmpC β-λακταμασών σε στελέχη εντεροβακτηριακών, τη συγκριτική εκτίμηση της αποτελεσματικότητας διαφόρων αναστολέων στην ανίχνευση τους,την αξιολόγηση ενός τροποποιημένου CLSI ESBL τεστ και αφετέρου την καταγραφή καιδιερεύνηση νεωτέρων καρβαπενεμασών που έχουν ανιχνευθεί πρόσφατα στην Ελληνική επικράτεια. Για την μελέτη των πλασμιδιακών AmpC β-λακταμασών έγινε έλεγχος 105 Εντεροβακτηριακών στελεχών (K.pneumoniae, E.coli, K.oxytoca, P.mirabilis) με μειωμένη ευαισθησία ή αντοχή στην κεφοξιτίνη (FOX) ή/και στην κεφοτετάνη (CTT) σε συνδιασμό με αντοχή ή μειωμένη ευαισθησία σε μία τουλάχιστον εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνη. Οι πλασμιδιακές AmpC, ESBL και VIM καρβαπενεμάσες ανιχνεύθηκαν με PCR και προσδιορίστηκαν με νουκλεοτιδική αλληλούχιση. Πραγματοποιήθηκαν τεστ ευαισθησίας με την μέθοδο διάχυσης δισκίων, προσδιορισμός MIC ερταπενέμης με Etest και διερεύνηση κλωνικότητας με ERIC-PCR και REP-PCR. Έγινε συγκριτική εκτίμηση τεσσάρων αναστολέων, της κλοξασιλλίνης (CLOX), του φαινύλ-βορονικού οξέος (PBA), του 3-ακετύλ-φαινύλ βορονικού οξέος (APA) και του 3-άμινο-φαινύλ βορονικού οξέως (APBA) το τελευταίο σε δύο συγκεντρώσεις με υποστρώματα την FOX, CTT, κεφταζιδίμη (CAZ) καικεφοταξίμη (CTX). Τέλος εκτιμήθηκε ένα τροποποιημένο CLSI ESBL τεστ με την χρήση των προηγούμενων αναστολέων.Συνολικά βρέθηκαν 59 στελέχη με πλασμιδιακές AmpC β-λακταμάσες, εκ των οποίων 35 έφεραν και ESBL. Η πλειονότητα των στελεχών έφερε την MOX-2 β-λακταμάση και ακολούθως την CMY-2. Σε μικρότερη συχνότητα βρέθηκαν η CMY-4, CMY-13 και CMY-31 καθώς και τρία πρωτοεμφανιζόμενα στην Ελλάδα ένζυμα η DHA-1 και δύο νεώτερες β-λακταμάσες μια CMY-4-like και μία MIR-2-like. Τα στελέχη P.mirabilis ανήκαν σε ένα κλώνο, οι K.oxytoca εμφάνιζαν δύο κλώνους με ένα διακριτό υπότυπο, ενώ οι E.coli καιK.pneumoniae διαχωρίστηκαν σε συνολικά 11 και 8 κλώνους αντίστοιχα.Η FOX υπερτερούσε σε σχέση με την CTT ως αρχικό screening. Όσον αφορά την επιβεβαιωτική φαινοτυπική μέθοδο η FOX σε συνδιασμό με το APBA δίνει τα καλύτερα αποτελέσματα αναγνωρίζοντας επιτυχώς 57/59 στελέχη. Το τροποποιημένο CLSI ESBL τεστ υπερείχε σημαντικά σε ευαισθησία και ειδικότητα με την χρήση CLOX (91,4%, 75%), PBA(100%, 75%) ή APBA (97,1%, 79,1%) σε σχέση με το κλασσικό CLSI ESBL τεστ (85,7%,58,3%). Συνολικά καλύτερα αποτελέσματα επιτεύχθηκαν με την χρήση του PBA. Το APAαπέτυχε να λειτουργήσει ικανοποιητικά εμφανίζοντας χαμηλή ευαισθησία (54,3%).Στην περίπτωση των NDM καρβαπενεμασών συνολικά έγινε έλεγχος 132 Εντεροβακτηριακών στελεχών με αντοχή στις καρβαπενέμες που είχαν συλλεχθεί από τον Ιανουάριο 2010 έως τον Ιούνιο 2013, έδιναν θετικό το τροποποιημένο Hodge τεστ (MHT) και τις φαινοτυπικές δοκιμασίες για παραγωγή μέταλλο-β-λακταμάσης (MBL). Συνολικά 78 στελέχη K.pneumoniae, που συγκεντρώθηκαν από 71 ασθενείς έφεραν το blaNDM-1 γονίδιο. Η πλειονότητα των στελεχών ήταν επίσης θετικά και για τα blaOXA-1, blaCTX-M-15 και blaTEM-1 γονίδια.. Η πλασμιδιακή ανάλυση έδειξε ότι το blaNDM-1 γονίδιο φέρεται επί ενός πλασμιδίου μεγέθους ~95kbp και ανήκει στο IncFII γκρουπ ασυμβατότητας. Ανάλυση του γενετικού περιβάλλοντος του blaNDM-1 γονιδίου έδειξε ότι του γονιδίου προηγείτο ένα μη διακεκομμένοISAba125 στοιχείο ενώ μετά το γονίδιο ακολουθεί το bleMBL γονίδιο. Η ERIC-PCR και ηPFGE ανέδειξαν ότι όλα τα στελέχη ανήκαν σε ένα διακριτό κλώνο Α, με μια υποομάδα Α1 και η MLST αντιστοίχησε τα στελέχη στο τύπο ST11. Μεταφορά της αντοχής στις καρβαπενεμάσες επιτεύχθηκε με πάρα πολύ χαμηλή συχνότητα ~ 1,3x10-7 διασυζευτικά στελέχη ανά κύτταρο δότη. Παρατηρήθηκαν δύο επιδημίες, η πρώτη από Νοέμβριο-Δεκέμβριο 2011, με 4 εμπλεκόμενους ασθενείς και η δεύτερη με έναρξη το Μάιο 2012 και συνεχιζόμενη, με τα υπόλοιπα περιστατικά. Για δύο ασθενείς θεμελιώθηκε η αυτόχθονος πρόσληψη των στελεχών από την κοινότητα. Δεν βρέθηκαν συνδετικά στοιχεία που να βεβαιώνουν έκθεση των περιστατικών σε ενδημικές περιοχές.Από τον Δεκέμβριο 2011 έως το Μάρτιο 2012 13 στελέχη K.pneumoniae με αντοχή στην ερταπενέμη, με θετικό MHT αλλά αρνητικές φαινοτυπικές δοκιμασίες για παραγωγή MBL καιKPC τύπου καρβαπενεμασών, απομονώθηκαν από 9 ασθενείς.Όλα τα στελέχη έφεραν το blaOXA-48 γονίδιο καθώς και το blaOXA-1 και blaCTX-M-15. Το blaOXA48 γονίδιο εντοπίστηκε επί συζευκτικού πλασμιδίου τάξης IncL/M μεγέθους ~62kb. Η ανάλυση του γενετικού περιβάλλοντος πιστοποίησε την παρουσία του IS1999 πριν το γονίδιο,σχηματίζοντας το μεταθετό στοιχείο Tn1999. Η ανάλυση αλληλουχιών των γονιδίων των μεμβρανικών πρωτεϊνών ompK35 και ompK36 δεν ανέδειξε μεταλλάξεις σχετιζόμενες με προβλήματα διαβατότητας. Η PFGE ομαδοποίησε τα στελέχη σε ένα διακριτό κλώνο, με δύο υπότυπους (Ια και Ιb) και η MLST αντιστοίχησε τα στελέχη στο ST11. Σε χρονικό διάστημα περίπου ίσο με 2,5 χρόνια και έναρξη το 2010 από τρία δείγματα ούρων ασθενούς, τα δύο πρώτα εκ των οποίων προσκομίσθηκαν με διαφορά 41 ημερών ενώ το τελευταίο μετά από 2,5 χρόνια, απομονώθηκαν στελέχη Κ.pneumoniae με αντοχή στις κεφαμυκίνες και στις εκτεταμένου φάσματος κεφαλοσπορίνες, θετικά φαινοτυπικά τεστ για παραγωγή AmpC β-λακταμάσης και αρνητικό τροποιημένο CLSI-ESBL τεστ. Τα δύο αρχικά στελέχη παρουσίαζαν επίσης αντοχή στις καρβαπενέμες, θετικό ΜΗΤ και αρνητικά φαινοτυπικά τεστ για παραγωγή καρβαπενεμάσης τάξης Α ή Β. Η μοριακή διερεύνηση αν έδειξε την παρουσία του blaOXA-162 γονιδίου καθώς και του blaOXA-1 και του blaDHA-1 στα δύο αρχικά στελέχη ενώ το τελευταίο ήταν αρνητικό για το blaOXA-162. Το IS1999 προηγείτο τουblaOXA-162. Δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις σχετιζόμενες με προβλήματα διαβατότητας. Η πλασμιδιακή ανάλυση έδειξε την ύπαρξη δύο μεγάλων πλασμιδίων ~140kb και ~62kb καθώς και ενός μικρότερου μεγέθους 2kb στα δύο πρώτα στελέχη, ενώ στο τελευταίο απουσίαζε το 62kb πλασμίδιο. Τα πειράματα σύζευξης δεν οδήγησαν στην δημιουργία διασυζευκτών. ΗPFGE ομαδοποίησε τα στελέχη σε ένα διακριτό κλώνο και η MLST τα αντιστοίχησε στοST11.