Φαινοτυπική και μοριακή μελέτη των β-λακταμασών ευρέως φάσματος και καρβαπενεμασών σε πολυανθεκτικά στελέχη εντεροβακτηριακών

Abstract

The primary purpose of this study was to investigate the distribution of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) in Greece, wich are the cause of severe resistance problems in nosocomial setting. During this study, there were also other serious issues that emerged and were subject to investigation, such as: the emergence in the Greek area of new enzymes, KPC carbapenemases; isolation of strains of particular interest that produced new and important β-lactamases. So, the execution of this study was based on four axes: 1. Determination of ESBL-types dominating in Greece.2. Development and estimation of phenotypic methods for detection and characterization of new β-lactamases, such as the KPC enzymes. 3. Phenotypic and molecular investigation of strains producing new and important β-lactamases and were isolated during the study. 4. Biochemical characterization of new β-lactamases in multiresistant bacteria with new phenotypes (characterization of VIM-12 metallo-β-lactamase). To achieve these objectives there were used phenotypic and molecular methods.In this study, there was investigated the distribution of ESBLs in the Greek region and the dominant types were determined. The CTX-M-type, the most frequently observed worldwide, was found to be the dominant type in our collection as well, with CTX-M-15 allele to be the most dominant among Κ. pneumoniae and CTX-M-3 allele among E. coli. SHV-5 ESBL was found mostly in Ε. cloacae and Κ. pneumoniae. ESBL-positive E. coli isolates were more susceptible to ceftazidime than Κ. pneumoniae due to the CTX-M-3 allele which provides lower levels of resistance to this antibiotic compared to CTX-M-15 and SHV-5. Also, the impact of the new breakpoints that were set by CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) in 2010 was studied and an increased susceptibility mostly to ceftazidime and cefepime was observed.In addition, a new method using boronic acid disks was developed and evaluated for the detection of KPC enzymes. It was estimated that it is simple, cheap and highly sensitive and specific, detecting accurately KPC producers. It was observed that KPC-producing strains of K. pneumonia contain heterogeneous subpopulations which grow at higher meropenem concentrations hence this antibiotic did not kill sufficiently these bacteria in vitro. However, the combination of meropenem and gentamicin killed efficiently and quickly these bacteria.In this study, there were also investigated strains of particular interest such as: one multiresistant strain of K. pneumoniae that was found to harbor a new metallo-β-lactamase, VIM-19, along with other β-lactamase genes (blaTEM-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2 και blaKPC-2); and one strain of K. pneumoniae which harbored the new VIM-12 metallo-β-lactamase that was biochemically characterized by determining its kinetic parameters.

Ο αρχικός σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση των β-λακταμασών ευρέως φάσματος (Extended-Spectrum Beta-Lactamases, ESBL) στον Ελληνικό χώρο, οι οποίες προκαλούν σοβαρά προβλήματα αντοχής στο νοσοκομειακό περιβάλλον. Κατά τη διάρκεια της μελέτης προέκυψαν και άλλα σοβαρά ζητήματα που αποτέλεσαν αντικείμενο έρευνας και προστέθηκαν στον αρχικό σκοπό της.Έτσι, οι στόχοι της μελέτης αυτής ήταν: 1. Προσδιορισμός των τύπων ESBL που επικρατούν στην Ελλάδα2. Ανάπτυξη και αξιολόγηση μεθόδων φαινοτυπικής ανίχνευσης και χαρακτηρισμού νεοεμφανισθέντων β-λακταμασών, όπως οι KPC3. Φαινοτυπική και μοριακή διερεύνηση στελεχών που απομονώθηκαν στη διάρκεια της μελέτης και που παράγουν νέες και σημαντικές β-λακταμάσες 4. Βιοχημικός χαρακτηρισμός νέας β-λακταμάσης, της VIM-12, σε πολυανθεκτικά βακτήρια με νέους φαινοτύπουςΓια την επίτευξη των στόχων αυτών χρησιμοποιήθηκαν φαινοτυπικές και μοριακές μέθοδοι. Έτσι, στην μελέτη αυτή διερευνήθηκε η διασπορά των ESBLs στον Ελληνικό χώρο και προσδιορίστηκαν οι επικρατέστεροι τύποι. Ο CTX-M τύπος ESBL βρέθηκε να επικρατεί και στη συλλογή μας, με το αλλήλιο CTX-M-15 να είναι το επικρατέστερο ανάμεσα στις Κ. pneumoniae και το αλλήλιο CTX-M-3 να επικρατεί ανάμεσα στις E. coli. Οι SHV-5 ESBLs βρέθηκαν κυρίως σε στελέχη Ε. cloacae και Κ. pneumoniae. Οι ESBL-θετικές E. coli ήταν πιο ευαίσθητες στην κεφταζιδίμη απ’ ότι οι Κ. pneumoniae, λόγω του CTX-M-3 αλληλίου που προσδίδει χαμηλότερα επίπεδα αντοχής στην κεφταζιδίμη σε σχέση με CTX-M-15 και SHV-5. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση των νέων ορίων ευαισθησίας που προτάθηκαν από το CLSI (Ινστιτούτο Κλινικών και Εργαστηριακών Προτύπων) το 2010 και παρατηρήθηκε αυξημένη ευαισθησία, κυρίως στην κεφταζιδίμη και την κεφεπίμη.Αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε η καινούργια μέθοδος με τη χρήση δισκίων βορονικού οξέος για την ανίχνευση KPC ενζύμων και εκτιμήθηκε ως μια απλή και φθηνή μέθοδος με μεγάλη ευαισθησία και ειδικότητα που με ακρίβεια μπορεί να διακρίνει στελέχη που παράγουν αυτά τα ένζυμα.Παρατηρήθηκε επίσης ότι στελέχη K. pneumoniae που παράγουν KPC περιέχουν ετερογενείς υποπληθυσμούς που αναπτύσσονται σε υψηλότερες συγκεντρώσεις μεροπενέμης γι’ αυτό και το αντιβιοτικό αυτό δεν θανάτωσε ικανοποιητικά in vitro αυτά τα βακτήρια. Ο συνδυασμός όμως μεροπενέμης με γενταμικίνη βρέθηκε ότι θανατώνει αποτελεσματικά και γρήγορα τα βακτήρια αυτά.Διερευνήθηκαν τέλος οι μηχανισμοί αντοχής σε ενδιαφέροντα στελέχη, όπως ένα πολυανθεκτικό στέλεχος K. pneumoniae που βρέθηκε να φέρει μια καινούργια μεταλλο-β-λακταμάση, την VIM-19, μαζί με άλλα γονίδια β-λακταμασών (blaTEM-1, blaCTX-M-15, blaCMY-2 και blaKPC-2) και ένα στέλεχος K. Pneumoniae με την καινούργια μεταλλο-β-λακταμάση VIM-12, της οποίας έγινε βιοχημικός χαρακτηρισμός και προσδιορίστηκαν οι κινητικές παράμετροι.