Επιγενετικοί μηχανισμοί στη λειτουργία του καρδιαγγειακού συστήματος σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική νόσο

Abstract

Sickle Cell Disease (SCD) is the most common inherited structural disorder of human hemoglobin. It is caused by a missence mutation on the 6th codon of the beta hemoglobin gene. The resulting form of hemoglobin tends to polymerize under hypoxic conditions, causing premature red blood cell destruction and vascular obstructive episodes. Despite being a hematological disease, clinical manifestations and complications implicate most organs and systems of human body. As far as the cardiovascular system is concerned, pulmonary hypertension is its most common and devastating complication. Moreover, Sickle Cell Disease features high clinical heterogeneity, explained by both genetic and environmental parameters. In the past few years, the function of various genes not exclusively related to hemopoesis has been related to Sickle Cell Disease clinical severity/prognosis, but only a minor part of its heterogeneity has been convincingly interpreted so far. Aim of the present thesis was to study genes related to vascular endothelial function and oxidative stress in patients suffering from Sickle Cell Disease. More specifically, single nucleotide polymorphisms of NOS3 and MTHFR genes, encoding endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) enzymes were studied. Furthermore, expression of genes encoding eNOS and superoxide dismutase 2 (SOD-2) enzymes, as well as HIF-1a and PGC-1a transcription factors, was studied on the mRNA level. Epigenetic regulation was studied on NOS3 and SOD2 genes by determining the methylation status of crucial cytosine-guanine islets on regulatory domains. On the polymorphism level, CC genotype for T→C polymorphism at -786 position of NOS3 promoter was related with sickle cell retinopathy in patients with S/S and β0/S genotype, while GG and GT genotypes for G→T polymorphism at +894 position at exon 7 of the same gene was related with higher hematocrit and hemoglobin values. MTHFR polymorphisms on positions +677 (C→T, exon 4) και +1298 (A→C, exon 7) were not related to clinical course or laboratory values of patients in the present study. NOS3 expression was similar between patients and controls, while SOD2, PPARGC1A and HIF1A expression was significantly lower in Sickle Cell Disease patients. Of interest, patients with echocardiographic markers of pulmonary hypertension featured lower SOD2 expression in comparison to other patients. Methylation study of NOS3 and SOD2 regulatory sequences by MSP (Methylation Specific PCR) revealed the presence of differentially methylated homologous sequences in both patients and controls, thus verifying their regulatory role in gene expression. However, these findings are not sufficient to interpret the difference in SOD2 expression between patients and controls, as both groups exhibited methylated and unmethylated sequences.

Η δρεπανοκυτταρική νόσος οφείλεται σε σημειακή μετάλλαξη στο 6ο κωδικόνιο του γονιδίου της β-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης Α. Η προκύπτουσα αιμοσφαιρίνη τείνει να πολυμερίζεται υπό συνθήκες υποξίας, προκαλώντας πρόωρη καταστροφή των ερυθρών αιμοσφαιρίων και φαινόμενα αγγειακής απόφραξης στους πάσχοντες. Χαρακτηρίζεται από εκδηλώσεις και επιπλοκές σε πολλά όργανα και ιστούς εκτός αιμοποιητικού συστήματος. Από το καρδιαγγειακό σύστημα, σημαντικότερη επιπλοκή της είναι η πνευμονική υπέρταση. Παράλληλα, χαρακτηρίζεται από κλινική ετερογένεια, που οφείλεται σε περιβαλλοντικούς και γενετικούς παράγοντες: τα τελευταία χρόνια, γονίδια που δε σχετίζονται άμεσα με τη λειτουργία της αιμοποίησης έχουν συσχετισθεί με τη βαρύτητα και τις επιπλοκές της νόσου. Μέχρι σήμερα έχει ερμηνευθεί μόνο ένα πολύ μικρό μέρος αυτής της κλινικής ετερογένειας. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκαν γονίδια που σχετίζονται με τη λειτουργία του αγγειακού ενδοθηλίου και το οξειδωτικό stress σε επίπεδο πολυμορφισμών ή/και γονιδιακής έκφρασης σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική νόσο. Συγκεκριμένα, μελετήθηκαν πολυμορφισμοί των γονιδίων NOS3 και MTHFR, που κωδικοποιούν τα ένζυμα «ενδοθηλιακή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου» (eNOS) και «αναγωγάση του μεθυλενοτετραϋδροφυλλικού οξέος» (MTHFR) αντίστοιχα. Παράλληλα, μελετήθηκε η έκφραση σε επίπεδο mRNA των ενζύμων eNOS και SOD2 και των μεταγραφικών παραγόντων HIF-1α και PGC-1α. Για τα δυο πρώτα ένζυμα, μελετήθηκε επιπλέον η κατάσταση μεθυλίωσης των νησιδίων κυτοσίνης-γουανίνης σε ρυθμιστικές περιοχές του DNA των αντίστοιχων γονιδίων. Σε ότι αφορά το σκέλος των πολυμορφισμών, ο γονότυπος CC ως προς τη θέση -786 (T→C) στον υποκινητή του NOS3 συσχετίσθηκε με την εμφάνιση αμφιβληστροειδοπάθειας σε ασθενείς με γονότυπο S/S και β0/S, ενώ στην ίδια ομάδα ασθενών οι γονότυποι GT και TT ως προς τη θέση +894 (G→T) στο εξώνιο 7 του NOS3 συσχετίστηκαν με υψηλότερες τιμές αιματοκρίτη-αιμοσφαιρίνης. Η μελέτη των πολυμορφισμών στις θέσεις +677 (C→T) και +1298 (A→C) στα εξώνια 4 και 7 αντίστοιχα του γονιδίου MTHFR δεν απέδωσε στατιστικά σημαντικές συσχετίσεις. Η έκφραση του NOS3 δε διέφερε μεταξύ ασθενών και υγιών, ενώ η έκφραση των SOD2, PPARGC1A και HIF1A ήταν σημαντικά μειωμένη στους ασθενείς σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Μάλιστα, οι ασθενείς με υπερηχοκαρδιογραφικές ενδείξεις πνευμονικής υπέρτασης έτειναν να εμφανίζουν μειωμένη έκφραση του SOD2 σε σχέση με τους υπόλοιπους ασθενείς. Η μελέτη της κατάστασης μεθυλίωσης των ρυθμιστικών αλληλουχιών των γονιδίων NOS3 και SOD2 με την τεχνική MSP (αντίδραση PCR ειδική για μεθυλίωση) ανέδειξε την παρουσία τόσο μεθυλιωμένων όσο και αμεθυλίωτων ομόλογων αλληλουχιών στα λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος. Ετσι, επιβεβαιώνεται ο δυνητικά ρυθμιστικός ρόλος της επιγενετικής αυτής τροποποίησης στην έκφραση των αντίστοιχων γονιδίων. Ομως, τα ευρήματα αυτά αφορούν εξίσου τόσο τους ασθενείς, όσο και τους υγιείς μάρτυρες. Κατά συνέπεια δεν είναι μόνον αυτά επαρκή για να ερμηνεύσουν τη διαφορά στην έκφραση του SOD2 σε επίπεδο mRNA μεταξύ ασθενών και μαρτύρων.