In vitro αξιολόγηση και in vivo φαρμακοκινητική / φαρμακοδυναμική μελέτη του εκχυλίσματος από τα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. με έμφαση στην αντιαθηρωματική δράση

Abstract

Background and aims: The aims of the present study were: 1) the production, identification and quantification of a solid aqueous saffron extract (Crocus sativus L., SFE), 2) the in vitro study of its stability and content in bioactive components, 3) the in vivo pharmacokinetic study of its main antioxidant component (crocetin after crocin hydrolysis) and 4) the investigation of its possible antiatherosclerotic properties in ApoE knockout mice (ApoE-/-) after the administration of 3 different doses (30-60-90 mg/ kg body weight) and its possible mechanism of action. Methods: The production of saffron aqueous extract was accomplished with the mixture of Crocus sativus L. stigmas with distilled water. The mixture was let in the refrigerator for 3 days till the extraction to be completed. The extract was then infiltrated and lyophilized. The lyophilized product was studied for its chemical composition with the help of semi-preparative HPLC analysis and NMR spectroscopy, and then quantified to identify its major components (crocin, safranal). The SFE was then studied for its stability concerning its major component, crocin. Intravenous and peros administration to 80 C57Bl/6J mice at a dose of 60 mg/kg body weight followed in order to assess the pharmacokinetic properties and bioavailability of the main bioactive component of SFE, crocetin (hydrolyzed form of crocin). Samples were collected at selected time points after administration (5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 and 240 min). The quantification of crocetin in biological samples (serum and tissues) was accomplished after the optimization of an HPLC-PDA analysis method. The data obtained (Concentration vs time) for both serum and tissue samples were subjected to both compartmental and non-compartmental PK analysis to estimate the pharmacokinetic parameters and characterize crocetin’s PK profile. Finally, for the estimation of SFE’s possible antiatherosclerotic/atheroprotective effect fifty male, ApoE-/- mice, fed high-fat diet (HFD) for 12 weeks, were randomized into 5 equally numbered groups: 1) Baseline group, euthanatized, without intervention on the 12th week, 2) three saffron groups (SF1, SF2, SF3) receiving HFD and 30-,60-,90mg/kg/day of SFE, respectively, for four weeks, peros through gavage, after reconstitution in water for injection (WFI), 3) control group (COG) receiving daily HFD and the same volume of WFI (four weeks). After blood sampling and euthanasia, aortic roots were excised and analyzed for the gene expression and/or percentage of aortic stenosis, relative content of macrophages, smooth muscle cells (SMCs), connective tissue, tumor necrosis factor-α (TNF-a), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), matrix metalloproteinases-2,-3,-9 (MMP-2,-3,-9) and their inhibitor (TIMP-2) and IL-6, with the use of immunohistochemical and qRT-PCR techniques.Results: The saffron extract (SFE) that was produced was found rich in crocins and picrocrocin, whereas safranal was found in very low concentrations due to its less polar character which requires organic solvents to be solubilized. As far as its stability is concerned, SFE remains stable (crocin concentration) when kept in room temperature for a long period of time (at least 18 months), and the reconstituted solution can be re-used for the first 24 hours after reconstitution. The one-compartment model was found to describe adequately the kinetics of SFE’s main metabolite crocetin after intravenous and peros administration. After peros administration of SFE at a dose of 60 mg/kg body weight Cmax was found to be 2.77 μg/mL (%CV 2.17) and 3.84 (%CV1.6) for free and total crocetin respectively, which shows that crocin is hydrolyzed into crocetin in the intestinal lumen and then quickly absorbed (Tmax=30 min). The measurement results of the studied tissue samples show that crocetin is mainly distributed in the liver and the kidneys, which are the basic organs of its biotransformation and elimination. No measurable crocetine concentrations could be obtained from both lungs and heart samples, most probably because of its fast glucuronidation into crocetin’s metabolite. Concerning crocetin’s metabolite, the measured concentration values reveal limited distribution to the studied tissues. The results of the PK study lead to the conclusion that the administered SFE dose (60 mg/kg) was capable in achieving serum concentration levels proportional to those estimated in healthy volunteers after administration of pure crocetin (7.5 up to 22.5 mg which is equivalent to 0.11-0.32 mg/kg body weight) (1) or after administration of crocin in mice (40 nmol or 1.12 mg/kg body weight) (2). These facts suggested the use of the dosage scheme between 30 and 90 mg/kg body weight/day which correspond to 2.90-8.70 mg/kg of pure crocetin or 0.33-0.33 mg/kg of crocin for the conduction of the study for the effect of SFE in atheromatosis and inflammation generally. The study of the effect of SFE in atheromatosis, revealed that the administration of the extract did not affect body weight and total cholesterol levels (p>0.05). High SFE dose significantly ameliorated glucose and triglycerides profiles compared to other groups (p<0.05). Following a dose-dependent-manner SFE considerably decreased aortic stenosis (p<0.05). Furthermore, increasing SFE doses proportionally reduced macrophages content and increased the content of collagen, elastin, SMCs, in plaques promoting more stable plaque phenotype compared to COG (p<0.05). Those effects seemed to be associated with considerable reduction (>30%) of IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p<0.05) and MMP-2/TIMP-2 ratio. RT-qPCR analysis reassured our previous results of immunohistochemistry.Conclusions: SFE is a stable lyophilized extract rich in all trans-crocins. The PK study allowed the estimation of basic PK parameters and the bioavailability of SFE’s main bioactive component, crocetin, after peros administration and helped in the selection of the right dosage range for the evaluation of SFE’s atheroprotective and anti-atherosclerotic effect. SFE exerted dose dependent anti-atherosclerotic and plaque-stabilizing effects in Apo-E-/- mice, probably mediated by favorable modification of inflammatory mechanisms.

Εισαγωγή και σκοπός: Στόχοι της παρούσας εργασίας ήταν 1) η παρασκευή, ταυτοποίηση και ποσοτικοποίηση ως προς τα κύρια δραστικά συστατικά στερεού υδατικού εκχυλίσματος των στιγμάτων του φυτού Crocus sativus (SFE) , 2) η in vitro μελέτη της σταθερότητας ως προς την περιεκτικότητά του σε δραστικά συστατικά, 3) η in vivo μελέτη της φαρμακοκινητικής του κύριου αντιοξειδωτικού συστατικού του (κροκετίνη μετά από υδρόλυση της κροκίνης) και 4) η διερεύνηση της πιθανής αντιαθηρωματικής του δράση σε εξειδικευμένο ζωικό πρότυπο (μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε, ApoE-/-) μετά από χορήγηση 3 διαφορετικών δόσεων (30 – 60 – 90 mg/kg σωματικού βάρους) και του πιθανού μηχανισμού δράσης.Μέθοδοι: Για την παρασκευή του υδατικού εκχυλίσματος τα στίγματα του φυτού Crocus sativus L. αναμίχθηκαν με απιονισμένο νερό και το μίγμα φυλάχθηκε για 3 ημέρες στο ψυγείο για να ολοκληρωθεί η εκχύλιση. Μετά το πέρας των 3 ημερών, το εκχύλισμα διηθήθηκε και ακολούθησε η λυοφιλοποίηση. Το λυόφιλο προϊόν αναλύθηκε ως προς τη χημική του σύσταση με εφαρμογή ημιπαρασκευαστικής HPLC και φασματοσκοπίας NMR, ποσοτικοποιήθηκε ως προς τα κύρια βιοδραστικά συστατικά (κροκίνη και σαφρανάλη) και μελετήθηκε για τη σταθερότητά του κατά τη φύλαξη ως προς την περιεκτικότητα σε κροκίνη (το κύριο δραστικό συστατικό). Στη συνέχεια, το εκχύλισμα χορηγήθηκε ενδοφλέβια και από του στόματος σε 80 wild type C57/Bl6J μύες σε δόση 60 mg/kg βάρους με σκοπό την εκτίμηση της φαρμακοκινητικής και της βιοδιαθεσιμότητας του κύριου βιοδραστικού μορίου της κροκετίνης (υδρολυμένη μορφή της κροκίνης που αποτελεί το βασικότερο συστατικό του εκχυλίσματος). Συνελέγησαν δείγματα αίματος και ιστών σε επιλεγμένα χρονικά σημεία μετά τη χορήγηση (5, 15, 30, 60, 90, 120, 180 και 240 min). Για την ποσοτικοποίηση της κροκετίνης στα βιολογικά δείγματα (ορός και ιστοί) βελτιστοποιήθηκε μεθοδος HPLC-PDA. Στα δεδομένα συγκέντρωσης-χρόνου που προέκυψαν τόσο για τον ορό όσο και για τους ιστούς εφαρμόστηκε διαμερισματική και μη-διαμερισματική φαρμακοκινητική ανάλυση με σκοπό την εκτίμηση των ΦΚ παραμέτρων. Για τη διερεύνηση της πιθανής αντιαθηρωματικής/αθηροπροστατευτικής δράσης, χρησιμοποιήθηκαν 50 μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoE-/-), που σιτίστηκαν για 12 εβδομάδες με διαβητογόνο-αθηρογόνο τροφή και τυχαιοποιήθηκαν σε 5 ισάριθμες ομάδες: 1) Την ομάδα baseline (BLG) που θανατώθηκε χωρίς παρέμβαση στις 12 εβδομάδες, 2) τις 3 ομάδες χορήγησης SFE (SF1, SF2, SF3) που έλαβαν εκχύλισμα κρόκου από το στόμα για 4 εβδομάδες καθημερινά σε δόση 30, 60 και 90 mg/kg αντίστοιχα και 3) την ομάδα ελέγχου (COG) που έλαβε απλό ενέσιμο ύδωρ από το στόμα για 4 εβδομάδες καθημερινά. Μετά τις αιμοληψίες και την ευθανασία των ζώων, παρασκευάστηκαν οι αορτές τους, αξιολογήθηκε η αορτική στένωση και οι αθηρωματικές αλλοιώσεις που εντοπίστηκαν μελετήθηκαν για την περιεκτικότητά τους σε μακροφάγα, λεία μυικά κύτταρα (SMCs), συνδετικό ιστό και ελαστίνη καθώς και για την έκφραση φλεγμονωδών παραγόντων όπως ο TNF-a, o MCP-1, οι μεταλλοπρωτεϊνάσες-2, -3, -9 (ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-3, ΜΜΡ-9) και ο αναστολέας τους TIMP-2 και η IL-6, χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημικές τεχνικές και RT-qPCR. Αποτελέσματα: Το SFE που παρασκευάστηκε είναι πλούσιο σε κροκίνες και πικροκροκίνη ενώ είναι εμφανής η χαμηλή περιεκτικότητα σε σαφρανάλη λόγω του λιγώτερο πολικού της χαρακτήρα και της υψηλότερης διαλυτότητάς της σε οργανικά μέσα. Σε ό,τι αφορά στη σταθερότητά του, το λυόφιλο εκχύλισμα παραμένει σταθερό ως προς την περιεκτικότητά του σε κροκίνη όταν φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου για μεγάλο χρονικό διάστημα (τουλάχιστον 18 μήνες) ενώ το ανασυσταμένο διάλυμα μπορεί να επαναχρησιμοποιηθεί εντός 24 ωρών από την παρασκευή του. Το μονοδιαμερισματικό φαρμακοκινητικό μοντέλο κατανομής βρέθηκε να περιγράφει ικανοποιητικά την κινητική του κύριου μεταβολίτη της κροκίνης την κροκετίνη, μετά από ενδοφλέβια και peros χορήγηση με πρωτοταξική κινητική απορρόφησης. Μετά από peros χορήγηση του SFE σε δόση 60mg/kg επιτυγχάνονται επίπεδα Cmax = 2.77 μg/mL (%CV 2.17) και 3.84 μg/mL (%CV 1.6) για την κροκετίνη και την ολική κροκετίνη (κροκετίνη + μεταβολίτης) αντίστοιχα, σε χρόνο 30 min μετά τη χορήγηση, γεγονός που δείχνει ότι η κροκίνη υδρολύεται σε κροκετίνη στον εντερικό σωλήνα και απορροφάται στη συνέχεια γρήγορα με χρόνο επίτευξης μέγιστης συγκέντρωση τα 30 min. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων στους ιστούς που μελετήθηκαν δείχνουν ότι η κροκετίνη φαίνεται να κατανέμεται κυρίως στο ήπαρ και τους νεφρούς, που είναι τα βασικά όργανα για τη βιομετατροπή και απομάκρυνσής της. Δεν ανιχνεύθηκαν μετρήσιμες τιμές για τη συγκέντρωση της κροκετίνης τόσο στους πνεύμονες όσο και στην καρδιά πιθανώς λόγω της ταχείας γλυκουρονιδίωσης προς τον αντίστοιχο μεταβολίτη. Σχετικά με τον μεταβολίτη της κροκετίνης, οι μετρούμενες συγκεντρώσεις δείχνουν περιορισμένη κατανομή στους ιστούς που μελετήθηκαν. Από τα αποτελέσματα της ΦΚ μελέτης προέκυψε ότι η χορηγηθείσα δόση του εκχυλίσματος (60mg/kg) οδήγησε σε επίπεδα συγκεντρώσεων κροκετίνης στον ορό του αίματος ανάλογα με αυτά που υπολογίστηκαν σε υγιείς εθελοντές μετά από χορήγηση καθαρής κροκετίνης (7,5 έως και 22,5 mg (1), που ισοδυναμεί με 0.11-0.32 mg/kg) και μετά την από του στόματος χορήγηση είτε κροκετίνης (40 nmol ή 0.37 mg/kg) είτε κροκίνης (40 nmol ή 1.12 mg/kg) σε μύες (2), και επέτρεψε την ασφαλή επιλογή δόσεων στο εύρος 30-90 mg/kg/ημέρα που αντιστοιχούν σε 2.90-8.70 mg/kg καθαρής κροκετίνης ή 0.33-0.66 mg/kg κροκίνης για να γίνει αξιολόγηση της αντιαθηρωματικής και αντιφλεγμονώδους δράσης του εκχυλίσματος. H μελέτη της επίδρασης του SFE στην αθηρωμάτωση έδειξε ότι το εκχύλισμα δεν επηρέασε το σωματικό βάρος των ζώων και τα επίπεδα ολικής χοληστερόλης (p>0.05). Η υψηλή δόση (90mg/kg βάρους) βελτίωσε σημαντικά το γλυκαιμικό προφίλ και τα επίπεδα των τριγλυκεριδίων σε σύγκριση με όλες τις άλλες ομάδες χορήγησης (p<0.05). Η μείωση της αορτικής στένωσης στις ομάδες των πειραματοζώων ακολούθησε δοσοεξαρτώμενη σχέση (p<0.05). Ακόμη, η αύξηση της δόσης SFE μείωσε αναλογικά το περιεχόμενο των αθηρωματικών αλλοιώσεων σε μακροφάγα και οδήγησε σε αυξημένα ποσοστά συνδετικού ιστού, ελαστίνης, κολλαγόνου και λείων μυικών κυττάρων οδηγώντας σε σταθερότερο φαινότυπο αθηρωμάτωσης σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (COG, p<0.05). Η επίδραση αυτή επιβεβαιώνεται και από τη σημαντική μείωση (>30%) των επιπέδων IL-6, TNF-a, MCP-1, MMP-2,-3,-9 (p<0.05) και της αναλογίας MMP-2/TIMP-2. Από την ανάλυση RT-qPCR, προέκυψαν παρόμοια αποτελέσματα που επιβεβαίωσαν τα αποτελέσματα της ανοσοϊστοχημείας. Πιο συγκεκριμένα, έδειξαν ότι η γονιδιακή έκφραση των αντιφλεγμονωδών παραγόντων IL-6, MCP-1 και TNF-a ήταν στατιστικά σημαντικά μειωμένη για όλες τις ομάδες μυών που έλαβαν υδατικό εκχύλισμα κρόκου σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (p<0.05) και μάλιστα η μείωση της έκφρασης ήταν δοσοεξαρτώμενη. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα για τις μεταλλοπρωτεϊνάσες που μετρήθηκαν (MMP-2, MMP-9), ενώ ο αναστολέας τους ΤΙΜΡ-2 –όπως ήταν αναμενόμενο- παρουσίασε αυξημένη έκφραση στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία.. Συμπεράσματα: To SFE είναι σταθερό λυόφιλο εκχύλισμα πλούσιο σε all trans-κροκίνη. Η φαρμακοκινητική μελετη επέτρεψε να προσδιοριστούν οι βασικές φαρμακοκινητικές παράμετροι και η σχετική βιοδιαθεσιμότητα του κύριου βιοδραστικού συστατικού, κροκετίνη, μετά από peros χορήγηση, ενώ ταυτόχρονα έδωσε τη δυνατότητα σωστής επιλογής του εύρους των δόσεων που χορηγήθηκαν για να γίνει αξιολόγηση της αθηροπροστατευτικής και αντιαθηρωματικής δράσης του εκχυλίσματος. Το SFE επέδειξε δοσοεξαρτώμενη αντιαθηρωματική δράση (μείωση έκτασης και σταθεροποίηση αθηρωματικών πλακών) σε μύες με ομόζυγη έλλειψη της απολιποπρωτεΐνης Ε (ApoE-/-) πιθανότατα μέσω της επίδρασης/τροποποίησης των μηχανισμών φλεγμονής της αθηρωματικής νόσου.