Μοριακός και βιοχημικός χαρακτηρισμός δομικών περιοχών της φωσφολιπάσης C ζήτα (PLCζ)

Abstract

Sperm-specific phospholipase C (PLC) activates early embryo development bytriggering intracellular calcium (Ca2+) oscillations in mammalian oocytesindistinguishable from those seen at fertilization. PLC is the smallest with the mostelementary domain organization among all mammalian PLC isoforms. Sperm-deliveredPLC catalyzes the hydrolysis of its membrane-bound phospholipid substrate PtdInsP2,generating cytosolic Ca2+ oscillations via the InsP3 signaling pathway. The aim of thisstudy was to investigate how discrete PLC domains contribute to the novel biochemicaland enzymatic properties of this protein resulting in Ca2+ release in the fertilizing oocyte.A number of techniques were employed including a chimeric analysis approach, sitedirected mutagenesis, cRNA microinjection in mouse oocytes, recombinant proteinexpression and purification, in vitro enzymatic assays, protein-lipid overlay andliposome binding assays. These data suggest that the EF hand domains are not solelyresponsible for the high Ca2+ sensitivity of PLC and that the membrane associationand binding of PLC to PIP2 is mediated by the C2 domain and the XY-linker region.Unlike somatic PLCs, the sperm PLC XY-linker does not mediate auto-inhibition of itsenzymatic activity since the positively-charged residues within the XY-linker play animportant role in the PLC interaction with PIP2 required for generating the Ca2+oscillations essential for mammalian fertilization. It is also demonstrated speciesspecificdifferences in the in vivo Ca2+ oscillation-inducing activity of human and mousePLC. Chimeric analysis suggests a novel role of the EF hands and XY-linker region inthe species-specific differences in PLC activity.

Η πρωτεΐνη PLCζ, που εντοπίζεται αποκλειστικά στο σπέρμα, ενεργοποιεί την πρώιμη εμβρυική ανάπτυξη επάγοντας ενδοκυτταρικές ταλαντώσεις Ca2+ σε ωάρια θηλαστικών όμοιες με εκείνες που παρατηρούνται κατά τη γονιμοποίηση. Η PLCζ αποτελεί την μικρότερη ισομορφή PLC των θηλαστικών, με την πιο στοιχειώδη οργάνωση δομικών περιοχών. Η PLCζ καταλύει την υδρόλυση του μεμβρανικού φωσφοϊνοσιτιδίου PtdInsP2 παράγοντας ταλαντώσεις Ca2+ στο κυτταρόπλασμα του ωαρίου μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού της InsP3. Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η διερεύνηση του τρόπου με τον οποίο οι δομικές περιοχές της PLCζ συμβάλουν στις νέες βιοχημικές και ενζυμικές ιδιότητες της πρωτεΐνης αυτής και συντελούν στην έκλυση Ca2+ στο γονιμοποιούμενο ωάριο. Χρησιμοποιήθηκε ένας αριθμός τεχνικών που περιλαμβάνουν σύνθεση χιμαιρικών αλληλουχιών, σημειο-κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση, μικροέγχυση cRNA σε ωάρια ποντικού, έκφραση και απομόνωση ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών, in vitro ενζυμικές δοκιμασίες, επίστρωση πρωτεΐνης σε λιπίδια και δοκιμασία σύνδεσης σε λιποσώματα. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η δομική περιοχήEF hands δεν είναι η μόνη υπεύθυνη για την ευαισθησία της PLCζ στο Ca2+ και ότι η δομική περιοχή C2 και ο συνδέτης XY μεσολαβούν στην πρόσδεση της PLCζ στη μεμβράνη και στη δέσμευσή της στην PtdInsP2. Σε αντίθεση με τις PLC των σωματικών κυττάρων, ο συνδέτης XY της PLCζ δεν προκαλεί αυτοαναστολή της ενζυμικής της δραστικότητας, από τη στιγμή που τα θετικά φορτισμένα αμινοξέα στην αλληλουχία του συνδέτη ΧΥ διαδραματίζουν ένα σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση της PLCζ με τηνPtdInsP2 για την παραγωγή ταλαντώσεων Ca2+ που είναι απαραίτητες για τη γονιμοποίηση στα θηλαστικά. Επίσης, παρουσιάζονται οι ειδο-ειδικές διαφορές στην invivo ικανότητα επαγωγής ταλαντώσεων Ca2+ των PLCζ του ανθρώπου και του ποντικού. Η χιμαιρική ανάλυση έρχεται να προτείνει ένα νέο ρόλο για τις δομικές περιοχές των EF hands και του συνδέτη XY στις ειδο-ειδικές διαφορές στην δραστικότητα της PLCζ.