In vitro μελέτη της διαδερμικής διαπέρασης της καντεσαρτάνης με χρήση τεχνικών πειραματικού σχεδιασμού

Abstract

Purpose: The in vitro skin permeation study of Candesartan Cilexetil, an antihypertensive drug, from transdermal gel formulations.Materials and Methods: The in vitro skin permeation of the drug from saturated transdermal gels was examined using modified Franz diffusion cells and three types of membranes: human epidermal membrane, epidermal membrane from hairless mice (both obtained from full thickness skin by the heat separation technique) and a synthetic membrane recently commercially made available, namely StratM™. The reference vehicle studied was an ethanol: glycerin: water (60:15:25 % v/v) cosolvent system, gelled with hydroxypropylcellulose. In order to improve the transdermal permeation of the drug, a number of suitable strategies was employed: chemical modification of the cilexetil ester prodrug to the active drug form candesartan by alkaline hydrolysis, addition of permeation enhancers, substitution of glycerin by the cosolvent glycerol formal, and ion pair formation using organic amines as counter ions for the drug. The determination of the important factors and their interactions affecting the cumulative amount Q (μg/cm2) of drug permeated at 24, 48 and 72 hours was carried out by the execution of appropriate 2-level full factorial designs. The drug concentration in the receptor fluid was determined using HPLC. Moreover, the possibility of ion pair formation between Triethanolamine and Candesartan was investigated employing NMR spectroscopy and mass spectrometry. Results:Among the permeation enhancers studied during the preliminary experiments, cineole was proven to be most effective. Thus, a 2^3 full factorial design was executed, the selected factors for which were as follows: A, the drug’s chemical form (Candesartan cilexetil ester or Candesartan), B, the type of cosolvent in the vehicle (Glycerin or Glycerol formal) and C, the concentration of Cineole (5 or 10% v/v). The ANOVA revealed statistically significant effects and thus it was possible to identify the important factors and their interactions in regard to the selected responses. Two out of the eight resulting gels, containing Candesartan, Glycerol formal and Cineole 5 or 10% v/v, exhibited flux values through human epidermal membrane, surpassing the Minimum required Transdermal Flux = 3,1 μg/cm2/h, up to 24h. Preliminary experiments, where Triethanolamine was incorporated as a counter ion for the drug, showed a further flux increase and a more sustained drug delivery. On this ground, 1Η-NMR spectroscopy and mass spectrometry experiments provided clear evidence of ion pair formation between Candesartan and Triethanolamine in solution. Subsequently, in order to obtain a hierarchical order of the factors influencing the mechanism by which the ion pairs of each drug improve the in vitro skin permeation, a 2^4 full factorial design was executed, the selected factors for which were as follows: A, the drug’s chemical form (Candesartan cilexetil ester or Candesartan), B, the concentration of Triethanolamine (0 or 5% v/v), C, the concentration of Cineole (0 or 10% v/v) and D, the type of cosolvent in the vehicle (Glycerin or Glycerol formal). It was obvious that the transdermal permeation increased markedly when all studied factors were at their high level (A: Candesartan, B: 5% Triethanolamine, C: 10% Cineole and D: Glycerol formal), and the suggested gel of the above composition demonstrated flux J 0-24 = 4,3 ± 0,8 μg/cm2/h, J 24-48 = 2,8 ± 0,5 μg/cm2/h and J 48-72 = 2,0 ± 0,4 μg/cm2/h through human epidermal membrane. Interesting were also the interactions between the factors, and specifically the fact that cineole was found to be necessary in order to increase the transdermal permeation of the Candesartan: Triethanolamine complex. Finally, the results of the suggested gel flux through hairless mice epidermal membrane and StratM™ greatly overestimated those through human epidermal membrane.Conclusions:Based on the factorial design results, an optimum composition for a Candesartan transdermal gel was justified for the development of a candidate transdermal formulation. NMR spectroscopy and mass spectrometry experiments confirmed the initial hypothesis of ion pair formation between Candesartan and Triethanolamine.

Σκοπός: H in vitro μελέτη της διαδερμικής διαπέρασης της Καντεσαρτάνης Σιλεξετίλης, ενός αντιυπερτασικού φαρμάκου, από γέλες διαδερμικής χορήγησης. Υλικά και μέθοδοι: H in vitro διαδερμική διαπέραση του φαρμάκου από κορεσμένες γέλες μελετήθηκε με τη χρήση τροποποιημένων κυττάρων διάχυσης Franz και τριών τύπων μεμβρανών: ανθρώπινη επιδερμική μεμβράνη, επιδερμική μεμβράνη από άτριχα ποντίκια (αποκτηθείσες από δέρμα πλήρους πάχους με τη μέθοδο του θερμικού διαχωρισμού) και μια συνθετική μεμβράνη πρόσφατα εμπορικά διαθέσιμη, τη StratM™. Ο φορέας αναφοράς που εξετάστηκε ήταν ένα σύστημα διαλυτών αιθανόλης: γλυκερίνης: νερού (60:15:25 % ο/ο), ο οποίος μορφοποιήθηκε σε γέλη μέσω της υδροξυπροπυλοκυτταρίνης. Εφαρμόστηκε ένας αριθμός κατάλληλων στρατηγικών βελτιστοποίησης της διαδερμικής διαπέρασης: χημική τροποποίηση του εστερικού προφαρμάκου Καντεσαρτάνη Σιλεξετίλη προς τη δραστική μορφή Καντεσαρτάνη μέσω αλκαλικής υδρόλυσης, προσθήκη επιταχυντών διαπέρασης, αντικατάσταση της γλυκερίνης με το συνδιαλύτη φορμάλη γλυκερίνης, και σχηματισμός ιονικού ζεύγους με τη χρήση οργανικών αμινών ως αντισταθμιστικών ιόντων για το φάρμακο. Ο καθορισμός των σημαντικών παραγόντων και των αλληλεπιδράσεών τους που επηρέαζαν την αθροιστική ποσότητα Q (μg/cm2) του διαπερνώντος φαρμάκου στις 24, 48 και 72 ώρες πραγματοποιήθηκε με την εκτέλεση κατάλληλων πλήρων παραγοντικών σχεδιασμών 2 επιπέδων. Η συγκέντρωση του φαρμάκου στο υγρό δέκτη προσδιορίστηκε με HPLC. Επιπλέον, η πιθανότητα σχηματισμού ιονικού ζεύγους μεταξύ της Καντεσαρτάνης και της Τριαιθανολαμίνης διερευνήθηκε με φασματοσκοπία NMR και φασματομετρία μαζών. Aποτελέσματα: Μεταξύ των επιταχυντών διαπέρασης που εξετάστηκαν κατά τη διάρκεια προκαταρκτικών πειραμάτων, η κινεόλη αποδείχθηκε ως ο πιο αποτελεσματικός. Έτσι, εκτελέστηκε ένας πλήρης 2^3 παραγοντικός σχεδιασμός, για τον οποίο επιλέχθηκαν οι εξής παράγοντες: A, η χημική μορφή του φαρμάκου (Εστέρας Καντεσαρτάνη Σιλεξετίλη ή Καντεσαρτάνη), B, ο τύπος του συνδιαλύτη στο φορέα (Γλυκερίνη ή Φορμάλη γλυκερίνης) και C, η συγκέντρωση της Κινεόλης (5 ή 10% ο/ο). Η ANOVA αποκάλυψε στατιστικώς σημαντικές επιδράσεις και έτσι ήταν δυνατό να αναγνωριστούν οι σημαντικοί παράγοντες και οι αλληλεπιδράσεις τους ως προς τις επιλεχθείσες αποκρίσεις. Δύο από τις οκτώ προκύπτουσες γέλες, που περιείχαν Καντεσαρτάνη, Φορμάλη γλυκερίνης και κινεόλη 5 ή 10 % ο/ο, επέδειξαν τιμές ροής μέσω ανθρώπινης επιδερμικής μεμβράνης ικανές να υπερκεράσουν τον απαιτούμενο Ελάχιστο Ρυθμό Διαδερμικής Διαπέρασης, ΕΡΔΔ = 3,1 μg/cm2/h, μέχρι και για 24h. Προκαταρκτικά πειράματα, όπου ενσωματώθηκε η Τριαιθανολαμίνη ως αντισταθμιστικό ιόν για το φάρμακο, έδειξαν μια περαιτέρω αύξηση της ροής και μια πιο παρατεταμένη χορήγηση. Στη βάση αυτήν, πειράματα φασματοσκοπίας 1Η-NMR και φασματομετρίας μαζών παρείχαν σαφείς αποδείξεις σχηματισμού ιονικού ζεύγους μεταξύ της Καντεσαρτάνης και της Τριαιθανολαμίνης σε διάλυμα. Ακολούθως, με στόχο μια ιεράρχηση των παραγόντων που επηρέαζαν το μηχανισμό μέσω του οποίου τα ιονικά ζεύγη κάθε φαρμάκου βελτιώνουν την in vitro διαδερμική διαπέραση, εκτελέστηκε ένας πλήρης 2^4 παραγοντικός σχεδιασμός, για τον οποίο επιλέχθηκαν οι εξής παράγοντες: A, η χημική μορφή του φαρμάκου (Εστέρας Καντεσαρτάνη Σιλεξετίλη ή Καντεσαρτάνη), B, η συγκέντρωση της Τριαιθανολαμίνης (0 ή 5% ο/ο), C, η συγκέντρωση της Κινεόλης (0 ή 10% ο/ο) και D, ο τύπος του συνδιαλύτη στο φορέα (Γλυκερίνη ή Φορμάλη γλυκερίνης). Κατέστη προφανές ότι η διαδερμική διαπέραση αυξήθηκε σε μεγάλο βαθμό όταν όλοι οι εξεταζόμενοι παράγοντες ήταν στο υψηλό τους επίπεδο (A: Καντεσαρτάνη, B: 5% Τριαιθανολαμίνη, C: 10% Κινεόλη και D: Φορμάλη γλυκερίνης), και η προτεινόμενη γέλη της ανωτέρω σύστασης επέδειξε ροή J 0-24 = 4,3 ± 0,8 μg/cm2/h, J 24-48 = 2,8 ± 0,5 μg/cm2/h και J 48-72 = 2,0 ± 0,4 μg/cm2/h μέσω ανθρώπινης επιδερμικής μεμβράνης. Ενδιαφέρουσες ήταν επίσης οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των παραγόντων, και ειδικότερα το γεγονός ότι η κινεόλη βρέθηκε να είναι απαραίτητη για την αύξηση της διαδερμικής διαπέρασης του συμπλόκου Καντεσαρτάνης: Τριαιθανολαμίνης. Τέλος, τα αποτελέσματα ροής από την προτεινόμενη γέλη μέσω επιδερμικής μεμβράνης άτριχων ποντικιών και της StratM™ υπερεκτιμούσαν σε μεγάλο βαθμό αυτά μέσω ανθρώπινης επιδερμικής μεμβράνης. Συμπεράσματα:Με βάση τα αποτελέσματα του παραγοντικού σχεδιασμού, προτάθηκε μια βέλτιστη σύσταση για μια γέλη Καντεσαρτάνης για διαδερμική χορήγηση με στόχο την ανάπτυξη ενός υποψήφιου διαδερμικού συστήματος. Πειράματα φασματοσκοπίας NMR και φασματομετρίας μαζών επιβεβαίωσαν την αρχική υπόθεση σχηματισμού ιονικού ζεύγους μεταξύ της Καντεσαρτάνης και της Τριαιθανολαμίνης.