Οξυγενή κονδυλώματα ορθοπρωκτικής περιοχής και ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία πρωκτού: έκφραση ανοσοϊστοχημικών δεικτών και γονότυπος του ιού HPV στην μελέτη της ενδοεπιθηλιακής νεοπλασίας του πρωκτού: σύγκριση ιστολογικών και κυτταρολογικών αποτελεσμάτων

Abstract

Anogenital HPV infection is the most common sexually transmitteddisease. It is widely accepted that cervical intraepithelial neoplasia (CIN) and cancer arestrongly related to HPV infection, which is the prerequisite for their occurrence. Followingthe same principals of oncogenesis (tumor suppressor genes inactivation, escape fromnormal apoptosis, increase of cellular proliferation, chromosomal instability) HPV isbelieved to play a crucial role in the occurrence of anal intraepithelial neoplasia (AIN),which can progress from low to high grade dysplasia and ultimately to invasive anal cancer.The annual incidence of anal cancer has significantly increased during the last decade,especially in high risk groups (homosexuals and HIV positive patients), so it is important toevaluate and manage appropriately those patients with anorectal condylomata acuminata,by using modern technology and techniques including endoscopy, cytology, pathology andmolecular biology (PCR HPV genotyping/Immunohistochemistry markers).METHOD & PATIENTS: During a period of 5 years (2008‐2013) 144 consecutive patientswere examined (33 females, 42 heterosexual males and 69 homosexual males / aged >18years) referred from University Dermatology and Referral Center of STD’s and AIDS, A.Syggros Hospital, and from Outpatient Gastroenterology Department of anorectal HPVdisease, NIMTS Hospital of Athens. Inclusion criteria were current or past HPV anogenitaldisease and screening of high risk population. Exclusion criteria were HIV seropositivity,recent immigration in Greece, age <18 years, severe mental disease or protocolnonacceptance.Patients underwent anoscopy with acetowhite stain and biopsies to detectintra‐anal disease. After anoscopy, cytology was performed for the identification of any dysplasia according to the Bethesda and AIN system, evaluated by two expert cytologists.The anal smears were blindly collected by brushing according to the Palefsky technique andcytology slides were stained and coverslipped using the standard Pap staining technique.Comparison of cytology and histology (eosin‐hematoxylin) was perfomed to evaluate thediagnostic accuracy of anal test Pap. Another part of biopsies was immunostained withp53, Ki67 and p16 antibodies. Finally, genotyping HPV DNA analysis was performed in anal240smears (Bioflux MagaBio/DiagCor Bioscience) and biopsies (Genomica). In the statisticanalysis histology was considered as the gold standard method and intra‐anal locationdefines the disease positivity .RESULTS: 133 patients (32 women, 61 homosexuals and 41 heterosexuals) fulfilled theinclusion criteria. The median age of anorectal HPV disease was 29 years. In total, 89.5% ofpatients were positive in HPV disease, with 84% LGSIL, 2.25% HGSIL, 2.5% SCC and 0.75%Buschke‐Lowenstein (1 patient). 65% of new entry patients were positive in HPV diseasecompared to 35% of patients referred for retesting after past disease. 4/5 of patients withexternal perianal warts were positive for intra‐anal disease. The group of homosexualspresented the 2/3 of all patients with dysplasia, while in the group of heterosexualsdysplasia also appeared in 12%. Sensitivity and Specificity of anoscopy in detection of HPVdisease was 89.1% and 71.4% respectively, Cytology 89.1% and 71.4% respectively,Cytology HPV DNA 86.6% and 64.3% respectively and Histology HPV DNA 92% and 72.2%respectively. The genotyping HPV control revealed high percentage of multiple infections(50%) with high prevalence of genotype 6 and 11 in all group of patients and 16, 18 ingroup of women and homosexuals. Other types detected were the benign 11, 40‐61, 55,57, 84‐26, 81 and the high risk 31, 33, 39, 45, 51, 52, 53, 58, 59, 66‐68, 70, 73, 82, while anunknown type was also detected. Total or partial genotyping identification with the twomethods was observed in 81% with a predominance of Cytology HPV DNA in detection ofmultiple infections. Immunohistochemistry stain completed in 111 patients and revealed30 samples (27%) negative in all stains (11 negative in HPV disease, 17 HPV, 2 AIN1) and 43samples positive (38.7%) in all stains (24 HPV, 13 AIN1, 6 AIN2,3 and SCC). In totalexpression of p53 was 68.5%, Ki67 60.4% and p16 46.8% without any sample positive inp16 with negative p53 and/or Ki67.CONCLUSIONS: The study of anorectal HPV disease in our sample of patients revealedhighprevalence of the disease, especially in patients with concomitant perianal disease andhomosexuals where we found also a higher prevalence of dysplasia. Conventionalanoscopy continues to be the cornerstone in diagnosis of HPV anorectal disease, while cytology presents a satisfying diagnostic accuracy that makes it an excellent tool as afuture screening method in high risk populations. Genotype profile of patients withanorectal disease in Greek area is similar to relative studies worldwide and this is anoptimist conclusion of the potential effect of vaccination program expansion in Greek241men. The study also revealed the need of an improved vaccine that it will cover more highrisk types, as well as the need of further investigation of more rare subtypes behavior.Concerning the immunohistichemical study of biomarkers, p53 presents a high expressionearly in the development of pre‐invasive anal lesions in contrast with p16 which seems tohave a more delayed and specific appearance in the malignant sequence. Finally, theadoption of specific guidelines in diagnosis and management of patients with anorectal HPV disease seems crucial.

Τα οξυτενή κονδυλώματα πρωκτογεννητικής περιοχής αποτελούν στις μέρες μας την πιο συχνή σεξουαλικά μεταδιδόμενη νόσο. Ως αιτιολογικός παράγοντας φέρεται ο ιός των κονδυλωμάτων HPV, ο οποίος συνδέεται ισχυρά με την ανάπτυξη καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Με ανάλογους μηχανισμούς καρκινογένεσης (αδρανοποίηση ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών, αναστολή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης,αύξηση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ενσωμάτωση στο DNA του ξενιστή) φαίνεται ότι επιδρά η λοίμωξη HPV και στην ορθοπρωκτική περιοχή οδηγώντας σε δυσπλασία, ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία και τελικά σε καρκίνο του πρωκτού. Δεδομένης της αύξησης του επιπολασμού της νόσου σε ειδικές ομάδες πληθυσμού (ομοφιλόφιλοι, HIVοροθετικοί, ασθενείς με προηγηθείσα HPV λοίμωξη) κρίνεται αναγκαία η σωστή διαχείριση των ασθενών με ορθοπρωκτικά οξυτενή κονδυλώματα και η υιοθέτηση σύγχρονων μεθόδων διερεύνησης, συμπεριλαμβανομένων της διαγνωστικής ενδοσκόπησης, κυτταρολογικής και ιστοπαθολογικής εξέτασης και των εφαρμογών της μοριακής βιολογίας (PCR γονοτυπική ανάλυση) και ανοσοϊστοχημείας. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΣ: Από το 2008 μέχρι το 2013 ελέγχθησαν 144 συναινετικοί ασθενείς(33 γυναίκες, 42 ετεροφυλόφιλoι άντρες και 69 ομοφυλόφιλοι άντρες ), ηλικίας >18 ετών,που προήλθαν από την Πανεπιστημιακή Δερματολογική Κλινική και το Τμήμα Σεξουαλικά Μεταδιδόμενων Νοσημάτων του Νοσοκομείου «Ανδρέας Συγγρός» καθώς και από το Εξωτερικό Ιατρείο Ελέγχου Ορθοπρωκτικών Κονδυλωμάτων, της Γαστρεντερολογικής Κλινικής του ΝΙΜΤΣ. Κριτήρια εισόδου στην μελέτη ήταν η ενεργός ή παρελθούσα HPV ορθοπρωκτογεννητική νόσος και ο έλεγχος ομάδων υψηλού κινδύνου, ενώ κριτήρια αποκλεισμού η HIV οροθετικότητα, η πρόσφατη μετανάστευση στην Ελλάδα, η ηλικία <18 ετών, η σοβαρή ψυχοδιανοητική νόσος και η μη αποδοχή του πρωτοκόλλου. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε έλεγχο της ορθοπρωκτικής περιοχής με ορθοσκόπηση, χρώση του βλεννογόνου με οξικό οξύ και λήψη βιοψιών προς ανάδειξη ή αποκλεισμό εσωτερικής ορθοπρωκτικής νόσου. Το ιστολογικό υλικό αξιολογήθηκε από δύο έμπειρους παθολογοανατόμους. Ακολούθησε τυφλή λήψη ορθοπρωκτικού επιχρίσματος με ψήκτρα 237 για κυτταρολογική εξέταση. Μονιμοποίηση και χρώση των επιχρισμάτων έγινε σύμφωνα με το τραχηλικό Pap Test και αξιολόγηση της δυσπλασίας σύμφωνα με το σύστημαBethesda και ΑΙΝ από δύο έμπειρους κυτταρολόγους. Παράλληλα στο βιοπτικό υλικό έγινε ανοσοϊστοχημικός έλεγχος για ανίχνευση της έκφρασης των δεικτών p53, Ki67 και p16.Τέλος οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε γονοτυπική HPV ανάλυση σε κυτταρολογικό υλικό(Bioflux MagaBio/DiagCor Bioscience) και ιστολογικό υλικό (Genomica) και έγινε καταγραφή των αποτελεσμάτων και μεταξύ τους σύγκριση. Ακολούθησε στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων, στην οποία ως μέθοδος αναφοράς θεωρήθηκε η ιστολογική εξέταση και ως παρουσία νόσου η ορθοπρωκτική εσωτερική εντόπιση των κονδυλωμάτων. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τους 144 αρχικούς ασθενείς συμπεριλήφθησαν στην μελέτη οι 133 (32 γυναίκες, 61 ομοφυλόφιλοι άντρες, 41 ετεροφυλόφιλοι άντρες). Μέση ηλικία εκδήλωσης νόσου (ορθοπρωκτικά εσωτερικά κονδυλώματα) ήταν τα 29 έτη. Στο σύνολο των ασθενών το 89.5% ήταν θετικοί στην HPV νόσο, με 84% LGSIL, 2.25% HGSIL, 2.25% SCCκαι 0.75% (1 περιστατικό) Buscke‐Lowenstein. Στατιστικά σημαντική στην εκδήλωση νόσου(ορθοπρωκτικά εσωτερικά κονδυλώματα) ήταν η πρωτοδιαγνωσθείσα νόσος σε σχέση με τον έλεγχο υποτροπής (65% θετικοί έναντι 35%) καθώς και η ύπαρξη εξωτερικών περιπρωκτικών κονδυλωμάτων (4/5 των ασθενών). Στη εμφάνιση δυσπλασίας σημαντικότερος παράγοντας ήταν ο σεξουαλικός προσανατολισμός, με τους ομοφυλόφιλους άντρες (ΜSM) να αποτελούν τα 2/3 των ασθενών με δυσπλασία ενώ η εμφάνιση αρχόμενης δυσπλασίας στους ετεροφυλόφιλους άντρες ανήλθε στο 12%. Hευαισθησία και ειδικότητα της ορθοσκόπησης ανευρέθη 94.1% και 78.6% αντίστοιχα, της κυτταρολογικής εξέτασης 89.1% και 71.4% αντίστοιχα, του κυτταρολογικού HPV DNA86.6% και 64.3% αντίστοιχα και του ιστολογικού HPV DNA 92% και 72.2% αντίστοιχα. Από τον γονοτυπικό HPV έλεγχο αναδείχθηκε υψηλό ποσοστό συλλοιμώξεων (50% του συνόλου) με υψηλό ποσοστό ανίχνευσης των γονοτύπων 6 και 11 σε όλες τις ομάδες ελέγχου και υψηλό ποσοστό των 16, 18 στις γυναίκες και ομοφυλόφιλους άντρες. Άλλοι γονότυποι που ανιχνεύθηκαν ήταν οι χαμηλής κακοηθείας 11, 40‐61, 55, 57, 84‐26, 81 και οι μέτριας προς υψηλής κακοηθείας γονότυποι 31, 33, 39, 45, 51, 52, 53, 58, 59, 66‐68, 70,73, και 82, ενώ εντοπίσθηκε και ένα δείγμα θετικό με άγνωστο, μη ταυτοποιημένο γονότυπο. Πλήρης ή μερική ταύτιση του γονοτυπικού ελέγχου με τις δύο μεθόδους παρατηρήθηκε στο 81%, με υπεροχή της κυτταρολογικής εξέτασης στην ανίχνευση 238 συλλοιμώξεων. Ο ανοσοϊστοχημικός έλεγχος ολοκληρώθηκε σε 111 ασθενείς και κατέδειξε 30 δείγματα (27%) αρνητικά και στους 3 δείκτες εκ των οποίων 11 αρνητικά γιαHPV λοίμωξη, 17 απλή HPV λοίμωξη και 2 ΑΙΝ1, και 43 δείγματα (38.7%) θετικά και στους 3 δείκτες εκ των οποίων 24 με απλή HPV λοίμωξη, 13 ΑΙΝ1, και 6 ΑΙΝ2,3 και SCC. Στο σύνολο των δειγμάτων η έκφραση του p53 ήταν 68.5%, του Ki67 60.4% και του p16 46.8%,ενώ κανένα από τα δείγματα δεν παρουσίασε θετικότητα στο p16 με αρνητικoύς και τους δύο δείκτες p53 και Ki67. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Η μελέτη της ορθοπρωκτικής νόσου στο δείγμα των ασθενών μας κατέδειξε υψηλό επιπολασμό νόσου, με υπεροχή στους ασθενείς με ταυτόχρονη περιπρωκτική εντόπιση και στους ομοφυλόφιλους ασθενείς όπου παρατηρήθηκε και υψηλότερο ποσοστό δυσπλασίας. Η συμβατική ορθοσκόπηση εξακολουθεί να αποτελεί τον ακρογωνιαίο λίθο στην διάγνωση της νόσου, με ικανοποιητική ωστόσο διαγνωστική ικανότητα της κυτταρολογικής εξέτασης που την καθιστά πολύτιμο εργαλείο ως μελλοντική μέθοδο ελέγχου πληθυσμών υψηλού κινδύνου. Το γονοτυπικό προφίλ των ασθενών στην ελληνική επικράτεια προσομοιάζει με αυτό των αντίστοιχων μελετών του εξωτερικού (υψηλό ποσοστό συλλοιμώξεων, υψηλό ποσοστό ανίχνευσης των υποτύπων 6,11,16,18) γεγονός που καταδεικνύει την δυνατότητα να επωφεληθεί η Ελλάδα από τυχόν επέκταση του προγράμματος εμβολιασμού στους άντρες με το ήδη υπάρχον εμβόλιο. Η μελέτη κατέδειξε επίσης την ανάγκη επέκτασης του εμβολιασμού ώστε να καλυφθούν και άλλοι υψηλού κινδύνου γονότυποι καθώς και την ανάγκη περαιτέρω μελέτης της συμπεριφοράς πιο σπάνιων γονοτύπων. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη των δεικτών p16, p53 και Ki67 καταδεικνύει τον p16 πιο αξιόπιστο δείκτη όσον αφορά την δυσπλασία και την εξέλιξη προς καρκίνο ενώ ο δείκτης p53 φαίνεται να υπολείπεται,καθώς εμφανίζεται πρόωρα στην αλληλουχία της καρκινογένεσης ακόμα και σε δείγματα με χαμηλόβαθμη δυσπλασία και φαίνεται να εξαρτάται και από τον γονότυπο του ιού.Τέλος, φαίνεται ότι είναι αναγκαία η θέσπιση ενιαίων κατευθυντήριων οδηγιών στην διάγνωση και στον χειρισμό ασθενών με HPV ορθοπρωκτική νόσο.