Μελέτη των παραγόντων απόκρισης σε βλάβες του DNA στην ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία του τραχήλου της μήτρας

Abstract

There is an ongoing quest for biomarkers improving the diagnosis of HPV-related cervical low- (LGSIL) and high-grade squamous intraepithelial lesions (HGSIL) and carcinomas, as well as predicting the eventual progression of SIL into carcinoma. Since dysregulation of the DNA damage response (DDR) has already been implicated in the pathogenesis of many malignant neoplasms, we investigated the immunohistochemical expression of γΗ2ΑΧ (the phosphorylated form of the histone protein H2AX) involved in DDR following double strand breaks (DSB). For this study, 275 cases concerning either “punch” biopsies or surgical specimens (conization, hysterectomy) were retrieved from the archival files of the 2nd Department of Pathology, National and Kapodistrian University of Athens (“Attikon” University Hospital). All intraepithelial lesions formerly classified according to the three-tiered CIN system were reclassified according to the newer, two-tiered Bethesda classification system. In total, 28 specimens with no essential lesions / within normal limits (WNL), 112 LGSIL, 99 HGSIL, 24 squamous cell carcinomas (SCC) and 12 adenocarcinomas (AdC) were included. In all cases a ThinPrep® liquid-based cytological sample had been previously collected and reported upon, according to the Bethesda classification; HPV DNA and mRNA detection were performed on this same cytological sample; LGSIL cases were accordingly divided into LGSIL-LR (related to lrHPV), LGSIL-HRna (related to hrHPV, non-activated, i.e. mRNA[-]) and LGSIL-HRa (related to hrHPV, activated, i.e. mRNA[+]). Immunostains against γH2AX and Ki67 proliferation index were performed on deparaffinized, 4 μm-thick sections from paraffin blocks. The percentage of cells with nuclear γΗ2ΑΧ immunopositivity for 100 consecutive cells was assessed for each specimen. In WNL, LGSIL and HGSIL cases, the basal and superficial halves of the stratified squamous epithelium were separately assessed. Statistical analysis was applied as needed. Results were as follows: i) a gradual increase in the number of immunostained cells for both halves of the epithelium from WNL to LGSIL-LR to LGSIL-HRna groups. ii) a gradual decrease in the number of immunostained cells for both halves of the epithelium from LGSIL-HRna to LGSIL-HRa to HGSIL groups. iii) an increased number of immunostained cells both in SCC and AdC compared to WNL and (uniquely for AdC) compared to some SIL groups. This is, to our best knowledge, the first study with a sizeable number of specimens, as well as with the aforementioned methodology ever performed concerning cervical lesions. Its results correlate with the up to now very scant data on similar lesions in squamous epithelia both of the cervix uteri and other sites (vulva, buccal cavity, lung); they may be interpreted in the light of the physical history of HPV infection and of the potential of the infected cell to cope with HPV-induced DSB, at least initially (i.e. in the LGSIL phase), whereas later on they seem to denote an “exhaustion” of the DDR mechanism. Moreover, they demonstrate the potential of immunostaining for γΗ2ΑΧ as a potential biomarker, both independent and eventually incorporated within relevant algorithms, in order to further facilitate and improve diagnosis, prognosis and post-treatment follow-up of cervical neoplastic lesions.

Στην παρούσα διατριβή αξιολογήθηκε η ανοσοϊστοχημική έκφραση της φωσφορυλιωμένης στο αμινοξύ σερίνη της θέσης 139 ιστόνης Η2ΑΧ (γΗ2ΑΧ) σε 275 δείγματα από βιοπτικά και εγχειρητικά παρασκευάσματα τραχήλου μήτρας: α) χωρίς εμφανείς μορφολογικές αλλοιώσεις (μάρτυρες), β) με όλο το φάσμα βαρύτητας των ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων πλακώδους επιθηλίου: τόσο χαμηλόβαθμες (LGSIL), όσο και υψηλόβαθμες (HGSIL) και γ) με ακανθοκυτταρικά καρκινώματα (SCC) και αδενοκαρκινώματα (AdC) τραχήλου μήτρας. Η ομάδα των LGSIL διαιρέθηκε περαιτέρω σε: α) σχετιζόμενες με λοίμωξη από lrHPV (LGSIL-LR), β) σχετιζόμενες με ανενεργό (non-activated) λοίμωξη από hrHPV (LGSIL-HRna), ήτοι χωρίς ανίχνευση mRNA και γ) σχετιζόμενες με ενεργό (activated) λοίμωξη από hrHPV (LGSIL-HRa), ήτοι με ανίχνευση mRNA. Πρόκειται, εξ όσων γνωρίζουμε, για την πρώτη δημοσιευμένη μελέτη σε ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις και καρκινώματα τραχήλου με παρόμοιο μέγεθος δείγματος και με τη συγκεκριμένη μεθοδολογία. Παρατηρήθηκε βαθμιαία αύξηση της έκφρασης της γΗ2ΑΧ τόσο στο βασικό, όσο και στο επιπολής ημιμόριο του πολυστίβου πλακώδους επιθηλίου από την ομάδα των τραχήλων χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις / μάρτυρες, σε αυτές των LGSIL-LR και των LGSIL-HRna. Εν συνεχεία, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης της γΗ2ΑΧ τόσο στο βασικό, όσο και στο επιπολής ημιμόριο του πολυστίβου πλακώδους επιθηλίου από την ομάδα των LGSIL-HRna σε αυτές των LGSIL-HRa και των HGSIL. Επιπλέον, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της γΗ2ΑΧ σε SCC και σε AdC σε σύγκριση με την ομάδα χωρίς ουσιώδεις αλλοιώσεις / μάρτυρες, καθώς και αυξημένη έκφραση της γΗ2ΑΧ σε αδενοκαρκινώματα σε σύγκριση με τις ομάδες LGSIL-LR και LGSIL-HR. Με δεδομένη την σημασία της ανίχνευσης της γΗ2ΑΧ ως δείκτη DSB / DDR, το αυξημένο ποσοστό έκφρασής της σε LGSIL, σε σχέση με την ομάδα των μαρτύρων, καταδεικνύει τον αυξημένο αριθμό παρομοίων γεγονότων στις χαμηλόβαθμες ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις. Η αύξηση αυτή ισχύει τόσο για το βασικό ημιμόριο του πολυστίβου πλακώδους επιθηλίου (στο οποίο εντοπίζονται τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της βασικής στιβάδας), όσο και για το επιπολής ημιμόριο (στο οποίο εντοπίζονται κατεξοχήν τα διαφοροποιούμενα κύτταρα).