Ανάλυση των μεταγραφικών επιπέδων των γονιδίων ΤΡ53, ΤΡ63 και ΤΡ73 και των ισομορφών ΤΑp63, ΔΝp63, ΤΑp73 και ΔΝp73 στον καρκίνο της ουροδόχου κύστεως

Abstract

The urinary bladder is a musculomembranous subperitoneal organ which functions asa reservoir for the urine in the human body. Urinary bladder cancer is the 11th mostcommon malignancy worldwide and the 4th most common among males in the UnitedStates, where 74,690 new cases will be diagnosed in 2014 alone. Smoking andoccupational exposure to aromatic amines are recognized as major risk factors for thedevelopment of the disease, followed by chronic urinary tract infection, Schistosomainfection in certain geographical regions, exposure to cyclophosphamide andradiotherapy to adjacent organs. It is estimated that 90-95% of bladder cancer casesare urothelial carcinomas, whereas the remaining 5-10% are mostly squamous cellcarcinomas and adenocarcinomas. Determination of tumor stage at diagnosis is crucialfor prognosis and patient management, as two major phenotypic variants of urothelialtumors with drastically different biological behavior have been recognized. Low-gradenon-muscle-invasive tumors, comprising approximately 80% of the cases, have limitedinvasive potential and come with favorable prognosis when treated early, althoughaccompanied by high recurrence rates. On the contrary, high-grade muscle-invasivetumors have very bad prognosis, with most of the patients developing life-threateningmetastases despite surgical resection and systemic therapy. The genetic alterationsunderlying the development of urothelial cancer include chromosomal aberrations,inactivating tumor-suppressor gene mutations and activation of oncogenes. FGFR3mutations are detected in more than 70% of non-muscle-invasive tumors, whereas p53is mutated in almost 50% of the muscle-invasive lesions.TP53 is the most extensively studied tumor-suppressor gene. Mutations in the TP53gene have been reported in the majority of human malignancies, suggesting asignificant contribution to the development and progression of human tumors. TwoTP53 homologs, TP63 and TP73, have recently been identified. Though highly similarwith p53 regarding genomic organization, both p63 and p73 utilize complexmechanisms to provide two major classes of protein isoforms with tumor-suppresive(TA-isoforms) or tumorigenic function (ΔN-isoforms). TAp63 and TAp73 exhibit p53-likefunction in terms of inducing apoptosis, whereas the N-terminally truncated ΔNp63 and ΔNp73 act as dominant negative inhibitors of both wild-type p53 protein and therespective TA-isoforms. Both TP63 and TP73 are rarely mutated in human tumors,whereas their deletion from mice results in various developmental and neurologicalabnormalities rather than the development of malignant lesions. Overall, it is evidentthat the two TP53 homologs are not to be considered as classic tumor-suppressorgenes.The objective of this PhD thesis was to determine the expression levels of the threep53 family genes (TP53, TP63, TP73) and the TP63 and TP73 TA and ΔN isoforms inbladder tumors and to evaluate any alterations in their expression patterns that mightbe associated with the development and progression of urothelial malignancies. Theexpression analysis was performed in a set of 30 urothelial tumors, matched withnormal tissues, which were obtained from bladder cancer patients who underwentsurgical resection of bladder tumor.Expression analysis revealed elevated p53, p63 and p73 mRNA levels in 47.0%, 40.0%and 43.0% of the samples, respectively. p53, p63 and p73 exhibited a 1.9-fold, 3.0-foldand 2.0-fold overexpression in tumor specimens compared with the normal samples,respectively. In the normal bladder epithelium, all members of the p53 gene familywere co-expressed (p <0.001). However, in malignant urothelium, only the positive coexpressionbetween p63 and p73 was maintained (p=0.008). Statistical analysisrevealed that p53 was up-regulated in non-muscle-invasive (pTa-T1) tumors comparedwith muscle-invasive (pT2-T4) ones (p=0.047). Significantly higher p63 mRNA levelswere measured in malignant samples from patients > 75 years of age versus youngerpatients (p=0.022) and from patients with disease relapse compared with cancer-freepatients (p=0.045). p63 expression significantly deviated from the normal pattern inpapillary versus non-papillary lesions (p=0.026). p73 overexpression was observed inGrade III tumors compared with Grade II tumors, in patients presenting with one-sitelesions (p=0.040).Also, elevated TAp63, ΔNp63, TAp73 and ΔNp73 mRNA levels were measured in 33.0%,50.0%, 40.0% and 37.0% of the samples, respectively. TAp63, ΔNp63, TAp73 andΔNp73 exhibited a 2.9-fold, 3.2-fold, 1.7-fold and 3.3-fold overexpression in tumorspecimens compared with the normal samples, respectively. Tumor-specific TAp63expression was detected in 3 cases, while TAp63 was expressed only in normal tissuein 4 cases. Tumor-specific ΔNp73 expression was detected in 7 cases, while ΔNp73 wasexpressed only in normal tissue in 4 cases. ΔNp73 was also not expressed in 3 tissuepairs. The ΔNp63/TAp63 isoform ratio shifted 1.1-fold in favor of ΔΝp63, and theΔNp73/TAp73 isoform ratio shifted 2.0-fold in favor of ΔΝp73 from normal to tumorspecimens. In normal urothelium TAp73 was co-expressed with ΔNp73 (p=0.003). Inthe malignant bladder epithelium ΔNp63 negatively correlated with TAp73 (p=0.006).Statistical analysis revealed that ΔΝp63 was up-regulated in tumor samples frombladder cancer patients > 75 years old versus younger ones (p=0.026), in non-muscleinvasive(pTa-T1) tumors versus muscle-invasive ones (pT2-T4) (p=0.019) and inpatients who received BCG treatment versus those who were treated with cystectomy(p=0.045). TAp73 mRNA levels were increased in patients with papillary tumorscompared with those with non-papillary ones (p=0.006) and in current smokerscompared with non-smokers and ex-smokers combined (p=0.020). Our results indicate that expression of all TP53 family members deviate from thenormal pattern in bladder tumors. p63 overexpression is associated with a lessaggressive tumor phenotype, whereas p73 up-regulation correlates with anunfavorable patient outcome. We also provide evidence that p63 and p73 exert theircontribution to the malignant transformation of the bladder epithelium independentlyof p53. In addition, our results support an anti-invasive role for ΔNp63 in urothelialcancers and a potentially protective effect of TAp73 on bladder epithelium. Finally, weprovide evidence for epigenetic regulation of p63 and p73 isoforms expression innormal and malignant urothelium.

Η ουροδόχος κύστη είναι ένα μυομεμβρανώδες υποπεριτοναϊκό όργανο, το οποίολειτουργεί ως δεξαμενή για τα ούρα στο ανθρώπινο σώμα. Ο καρκίνος της ουροδόχουκύστεως είναι η 11η πιο συχνή μορφή κακοήθειας στον κόσμο και η 4η μεταξύ τωνανδρών στις ΗΠΑ, όπου μόνο το 2014 θα διαγνωσθούν 74.690 νέα περιστατικά τηςνόσου. Το κάπνισμα και η έκθεση στις αρωματικές αμίνες έχουν αναγνωρισθεί ωςκύριοι παράγοντες κινδύνου για την εμφάνιση της νόσου, ενώ ακολουθούν οι χρόνιεςλοιμώξεις της ουροποιητικής οδού, η μόλυνση από το παράσιτο Schistosoma σεσυγκεκριμένες γεωγραφικές περιοχές, η έκθεση στην κυκλοφωσφαμίδη και ηακτινοθεραπεία σε παρακείμενα όργανα. Υπολογίζεται ότι το 90-95% των όγκων είναιουροθηλιακά καρκινώματα, ενώ το υπόλοιπο 5-10% είναι ως επί το πλείστονκαρκινώματα εκ πλακώδους επιθηλίου και αδενοκαρκινώματα. Ο καθορισμός τουπαθολογικού σταδίου του όγκου κατά την διάγνωση είναι καθοριστικής σημασίας γιατην πρόγνωση, καθώς έχουν αναγνωρισθεί δύο φαινοτυπικές μορφές της νόσου μεριζικά διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Οι καλά διαφοροποιημένοι (χαμηλούgrade), μη μυοδιηθητικοί όγκοι αποτελούν το 80% των περιστατικών, έχουνπεριορισμένο μεταστατικό δυναμικό και ευνοϊκή πρόγνωση όταν αντιμετωπιστούνέγκαιρα, αν και συνοδεύονται από υψηλά ποσοστά υποτροπών. Αντίθετα, οι φτωχάδιαφοροποιημένοι (υψηλού grade) μυοδιηθητικοί όγκοι έχουν πολύ κακή πρόγνωση,με τους περισσότερους ασθενείς να εμφανίζουν θανάσιμες μεταστάσεις παρά τηνχειρουργική αφαίρεση και την συστημική θεραπεία. Οι γενετικές μεταβολές πουυπόκεινται στην εμφάνιση της νόσου περιλαμβάνουν χρωμοσωμικές ανωμαλίες,μεταλλάξεις που απενεργοποιούν ογκοκατασταλτικά γονίδια και ενεργοποίησηογκογονιδίων. Μεταλλάξεις στον FGFR3 ανιχνεύονται σε περισσότερους από το 70%των μη μυοδιηθητικών όγκων, ενώ το p53 βρίσκεται μεταλλαγμένο σε περίπου 50%των μυοδιηθητικών όγκων. Το TP53 είναι το καλύτερα μελετημένο ογκοκατασταλτικό γονίδιο. Μεταλλάξεις στογονίδιο TP53 έχουν αναφερθεί στην πλειοψηφία των ανθρώπινων όγκων, γεγονόςπου υποδεικνύει σημαντική συνεισφορά του γονιδίου αυτού στην εμφάνισηκακοηθειών. Πρόσφατα, αναγνωρίσθηκαν τα ομόλογα γονίδια του TP53, τα TP63 και TP73. Αν και εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες με το TP53 όσον αφορά τηνγονιδιακή οργάνωση, τα TP63 και TP73 χρησιμοποιούν περίπλοκους μηχανισμούςπροκειμένου να παράξουν δύο κύριες κατηγορίες πρωτεϊνικών ισομορφών μεογκοκατασταλτική (ΤΑ ισομορφές) ή με ογκογόνο δράση (ΔN ισομορφές). Οιισομορφές TAp63 και TAp73 έχουν δράση παρόμοια με την p53 όσον αφορά τηνεπαγωγή της απόπτωσης, ενώ οι ΔNp63 και ΔNp73 (από τις οποίες λείπει τοαμινοτελικό άκρο) ρυθμίζουν με αρνητικό επικρατή τρόπο την αγρίου τύπου p53πρωτεΐνη, αλλά και τις αντίστοιχες ΤΑ ισομορφές. Μεταλλάξεις στα TP63 και TP73σπάνια ανιχνεύονται στους ανθρώπινους όγκους, ενώ η απαλειφή τους απόπειραματόζωα έχει ως αποτέλεσμα την εμφάνιση σοβαρότατων αναπτυξιακών καινευρολογικών ανωμαλιών παρά την ανάπτυξη καρκινικών όγκων. Είναι λοιπόνπροφανές ότι τα TP63 και TP73 δεν μπορεί να θεωρούνται κλασικά ογκοκατασταλτικάγονίδια.Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν ο προσδιορισμός τωνμεταγραφικών επιπέδων των τριών γονιδίων της οικογένειας p53 (TP53, TP63, TP73) και των TA και ΔN ισομορφών των γονιδίων TP63 και TP73 και η αξιολόγηση πιθανώνμεταβολών στα πρότυπα έκφρασής τους οι οποίες θα μπορούσαν να συσχετισθούν μετην εμφάνιση και την εξέλιξη της νόσου. Η ανάλυση της έκφρασης πραγματοποιήθηκεσε 30 ουροθηλιακούς καρκίνους, και 30 αντίστοιχους φυσιολογικούς ιστούς, οι οποίοιελήφθησαν από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστεως που υπεβλήθησαν σεχειρουργική αφαίρεση του όγκου.Η ανάλυση έδειξε αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα των p53, p63 and p73 στο 47,0%,40,0% και 43,0% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Υπερέκφραση των p53, p63 και p73 κατά1,9, 3,0 και 2,0 φορές αντίστοιχα ανιχνεύθηκε στα καρκινικά δείγματα σε σύγκριση μετα φυσιολογικά. Στο φυσιολογικό ουροθήλιο, όλα τα γονίδια της οικογένειας p53συνεκφράστηκαν (p <0,001). Όμως, στο καρκινικό ουροθήλιο, διατηρήθηκε μόνο ησυνέκφραση των p63 και p73 (p=0,008). Η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι το p53υπερκφράζεται στους μη μυοδιηθητικούς όγκους (παθολογικών σταδίων Τα-Τ1) σεσύγκριση με τους μυοδιηθητικούς (παθολογικών σταδίων Τ2-Τ4) (p=0,047). Σημαντικάυψηλότερα μεταγραφικά επίπεδα του p63 μετρήθηκαν σε καρκινικά δείγματα απόασθενείς άνω των 75 ετών σε σύγκριση με αυτά από νεότερους (p=0,022) και από ασθενείς με υποτροπή της νόσου σε σύγκριση με αυτά από ασθενείς χωρίς υποτροπή(p=0,045). Η έκφραση του p63 βρέθηκε να αποκλίνει σημαντικά από το φυσιολογικόπρότυπο στους θηλώδεις όγκους σε σύγκριση με τους μη θηλώδεις (p=0,026).Παρατηρήθηκε υπερέκφραση του p73 στους υψηλού grade (grade III) όγκους σεσύγκριση με τους grade II όγκους, σε ασθενείς που διαγνώσθηκαν με μονήρεις όγκους(p=0,040).Επίσης, αυξημένα μεταγραφικά επίπεδα των ισομορφών TAp63, ΔNp63, TAp73 καιΔNp73 μετρήθηκαν σε 33,0%, 50,0%, 40,0% και 37,0% των δειγμάτων, αντίστοιχα.Υπερέκφραση των TAp63, ΔNp63, TAp73 και ΔNp73 κατά 2,9, 3,2, 1,7 και 3,3 φορέςαντίστοιχα ανιχνεύθηκε στα καρκινικά δείγματα σε σύγκριση με τα φυσιολογικά.Μετάγραφα της ισομορφής TAp63 ανιχνεύθηκαν μόνο στο καρκινικό δείγμα σε 3περιπτώσεις, ενώ τα ίδια μετάγραφα ανιχνεύθηκαν μόνο στο φυσιολογικό δείγμα σε4 περιπτώσεις. Μετάγραφα της ισομορφής ΔNp73 ανιχνεύθηκαν μόνο στο καρκινικόδείγμα σε 7 περιπτώσεις, ενώ τα ίδια μετάγραφα ανιχνεύθηκαν μόνο στοφυσιολογικό δείγμα σε 4 περιπτώσεις. Επίσης, μετάγραφα της ισομορφής ΔNp73 δεν ανιχνεύθηκαν σε 3 ζεύγη ιστών. Ο λόγος έκφρασης ΔNp63/TAp63 αυξήθηκε κατά 1,1φορά υπέρ της ισομορφής ΔΝp63, και ο αντίστοιχος λόγος ΔNp73/TAp73 αυξήθηκεκατά 2,0 φορές υπέρ της ισομορφής ΔΝp73 από τα φυσιολογικά στα καρκινικάδείγματα. Στο φυσιολογικό ουροθήλιο, οι ισομορφές TAp73 και ΔNp73συνεκφράστηκαν (p=0,003). Στο καρκινικό ουροθήλιο, η έκφραση των ισομορφώνΔNp63 και TAp73 εμφάνισε αρνητική συσχέτιση (p=0,006). Η στατιστική ανάλυσηέδειξε ότι η ισομορφή ΔΝp63 υπερεκφράζεται στα καρκινικά δείγματα από ασθενείςάνω των 75 ετών σε σύγκριση με αυτά από νεότερους (p=0,026), στους μημυοδιηθητικούς όγκους (παθολογικών σταδίων Τα-Τ1) σ ε σ ύγκριση μ ε τ ουςμυοδιηθητικούς (παθολογικών σταδίων Τ2-Τ4) (p=0,019) και σε ασθενείς πουυπεβλήθησαν σε θεραπεία BCG σε σ ύγκριση μ ε α υτούς π ου υ πεβλήθησαν σ εκυστεκτομή (p=0,045). Σημαντικά υψηλότερα μεταγραφικά επίπεδα της ισομορφήςTAp73 μετρήθηκαν σε ασθενείς με θηλώδεις όγκους σε σύγκριση με τους ασθενείς μεμη θηλώδεις όγκους (p=0,006) και σε καπνιστές σε σύγκριση με τους μη καπνιστές καιτους πρώην καπνιστές αθροιστικά (p=0,020). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση και των τριών γονιδίων της οικογένειαςp53 αποκλίνει από το φυσιολογικό πρότυπο στους όγκους της ουροδόχου κύστεως. Ηυπερέκφραση του p63 συσχετίσθηκε με έναν λιγότερο επιθετικό φαινότυπο, ενώ ηυπερέκφραση του p73 συσχετίσθηκε με μη ευνοϊκή πρόγνωση. Επίσης, παρέχονταιενδείξεις ότι τα p63 and p73 συμβάλλουν στον κακοήθη μετασχηματισμό τουουροθηλίου ανεξάρτητα από το p53. Επίσης, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν τοναντι-διηθητικό ρόλο που έχει προταθεί για την ισομορφή ΔNp63 στουςουροθηλιακούς καρκίνους, αλλά και μία πιθανόν προστατευτική επίδραση τηςισομορφής TAp73 στο ουροθήλιο. Τέλος, παρέχονται ενδείξεις για επιγενετικήρύθμιση της έκφρασης των ισομορφών των p63 and p73 στο φυσιολογικό και τοκαρκινικό ουροθήλιο.