Μοριακή ανάλυση των μεταλλάξεων του PIG-A γονιδίου στις νόσους ανεπαρκείας του μυελού των οστών

Abstract

Acquired bone marrow failure syndromes characterized by aplastic orhypoplastic bone marrow namely, acquired aplastic anaemia (AA),paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH), myelodysplastic syndromes(MDS), seem to share common pathophysiological mechanisms andincreased genetic instability and mutation frequency. Despite the variableclinical course of AA and PNH, many patients evolve to MDS and acutemyeloid leukemia (AML). We studied the incidence of a PIG-A specificmutational hot spot -5bp deletion GTACT-, FLT3-ITD mutation, and NPM1mutations in blood and bone marrow samples from 1 AA patient and 1AA/PNH patient, 17 PNH patients, 85 MDS patients, 24 AML patients, 16chronic myeloid leukemia (CML). Bone marrow DNA was available in 14transformed patients, both in MDS stage and AML transformation. We alsoscreened DNA samples, extracted from peripheral blood of 48 healthy donors.PIG-A 5bp deletion was detected after first round PCR only in 3 PNH patient.Using the semi-nested PCR approach we found positive the AA/PNH patient,and 4/17 PNH patients (3 were positive from first round PCR), 9 positivesamples out of 48 in healthy individuals (18.75%), 14/85 in MDS samples(16.5%). From the 14 paired MDS/AML samples, one was positive in MDSstage but the mutation was not detected after transition to AML. One sample,tested negative during the MDS phase of the disease, was found positiveduring transition to AML. Positive FLT3-ITD samples were not seen in AA,AA/PNH, PNH and CML patients. In contrast positive FLT3-ITD samples were detected in 8/85 MDS patients (9.41%) and 10/24 AML patients (41.67%).From the 14 paired MDS/AML samples, 3 were FLT3-ITD positive in MDSstage and the mutation was still detected after transition to AML. One sample, tested FLT3-ITD negative during the MDS phase of the disease, was foundpositive during transition to AML. NPM1 mutations were detected only in 2 denovo AML patients simultaneously with FLT3-ITD mutation and in one CMLpatient in complete molecular response during imatinib therapy. Finally wetried to identify if a common pattern of genomic changes occur in differentMDS patients during their transformation to AML, using chromosomal-Comparative Genomic Hybridization (ch-CGH). A common pattern ofchromosomal loci gains was shared between MDS patients during AMLtransformation. The finding of common chromosomal loci gains duringtransition of MDS to AML is extremely important, given the wide clinical andgenetic heterogeneity of MDS patients. Further studies, to document ifincreased gene dosage results in enhanced transcription/translation and thuscontributes to leukemogenesis, have to be done. Furthermore, this study demonstrates that PNH+ cells if present in bone marrow failure syndromesare not the one selected for blast cell evolution during transformation to AML.

Τα επίκτητα σύνδρομα ανεπαρκείας του μυελού των οστών αποτελούν, η επίκτητη απλαστική αναιμία (ΑΑ), η παροξυσμική νυχτερινή αιμοσφαιρινουρία (ΠΝΑ), τα μυελοδυσπλαστικά σύνδρομα (ΜΔΣ), χαρακτηρίζονται από απλαστικό ή υποπλαστικό μυελό των οστών και φαίνεται ότι μοιράζονται κοινούς παθοφυσιολογικούς μηχανισμούς, αυξημένη γενωμική αστάθεια και αυξημένη συχνότητα εξέλιξης σε οξεία μυελογενή λευχαιμία (ΟΜΛ).Μελετήσαμε τη συχνότητα μιας συγκεκριμένης έλλειψης 5 βάσεων του γονιδίου PIG-A -5bp deletion GTACT- και τις μεταλλάξεις FLT3-ITD και NPM1σε δείγματα αίματος και μυελού των οστών στους ακόλουθους ασθενείς:1 με ΑΑ, 1 με ΑΑ/ΠΝΑ, 17 με ΠΝΑ, 85 με ΜΔΣ, 24 με ΟΜΛ, 16 με χρονία μυελογενή λευχαιμία (ΧΜΛ) και σε 48 υγιείς μάρτυρες. Υπήρχε διαθέσιμοDNA σε 14 ασθενείς τόσο κατά τη διάγνωση του ΜΔΣ όσο και κατά την εξέλιξη σε ΟΜΛ. Η έλλειψη των 5 βάσεων του γονιδίου PIG-A ανιχνεύθηκε μετά την πρώτη PCR μόνο σε 3 ασθενείς με ΠΝΑ. Με την semi-nested PCR η έλλειψη των 5 βάσεων του γονιδίου PIG-A ανιχνεύθηκε στον ασθενή με την ΑΑ/ΠΝΑ, σε 4/17 ασθενείς με ΠΝΑ, σε 9/48 υγιείς μάρτυρες (18.75%) και σε 14/85 ασθενείς με ΜΔΣ (16.5%). Από τα 14 διπλά δείγματα ΜΔΣ/ΟΜΛ, μόνο ένα ήταν θετικό κατά τη διάγνωση του ΜΔΣ, όμως η μετάλλαξη δεν ανιχνεύθηκε κατά την εξέλιξη σε ΟΜΛ. Αντίθετα, ένα δείγμα το οποίο ήταν αρνητικό στη διάγνωση του ΜΔΣ, ανευρέθη θετικό κατά την εξέλιξη σε ΟΜΛ. Θετικά δείγματα για τη μετάλλαξη FLT3-ITD ανιχνεύθησαν σε 8/85 ασθενείς με ΜΔΣ (9.41%) και σε 10/24 ασθενείς με ΟΜΛ (41.67%), ενώ δεν ανιχνεύθησαν μεταξύ των ασθενών με ΑΑ, ΑΑ/ΠΝΑ, ΠΝΑ και ΧΜΛ. Από τα3/14 διπλά δείγματα ΜΔΣ/ΟΜΛ, ήταν θετικά για τη μετάλλαξη FLT3-ITD κατά τη διάγνωση του ΜΔΣ, ενώ η μετάλλαξη συνέχισε να ανιχνεύεται και μετά την εξέλιξη σε ΟΜΛ. Ένα αρνητικό δείγμα για τη μετάλλαξη FLT3-ITD κατά τη διάγνωση του ΜΔΣ, θετικοποιήθηκε κατά την εξέλιξη σε ΟΜΛ. Μεταλλάξεις της NPM1 ανιχνεύθησαν μόνο σε δύο ασθενείς με de novo ΟΜΛ ταυτόχρονα με τη μετάλλαξη FLT3-ITD και σε έναν ασθενή με ΧΜΛ σε πλήρη μοριακή ύφεση υπό αγωγή με imatinib. Τέλος, προσπαθήσαμε να εξηγήσουμε το γενετικό εκείνο γεγονός που μεταλλάσει τα αιμοποιητικά κύτταρα και προκαλεί μια κλωνική διαταραχή σε διαφορετικούς ασθενείς με ΜΔΣ κατά την εξέλιξή τους σε ΟΜΛ, χρησιμοποιώντας τον συγκριτικό χρωμοσωμικό υβριδισμό (chCGH).Παρατηρήθηκε ένα κοινό πρότυπο ενίσχυσης συγκεκριμένων χρωμοσωμικών θέσεων σε διαφορετικούς ασθενείς με ΜΔΣ κατά την εκτροπή τους σε ΟΜΛ. Περαιτέρω μελέτες θα πρέπει να γίνουν για να αποδειχθεί αν η περίσσεια γενωμικού υλικού οδηγεί σε αυξημένη μεταγραφή/μετάφραση και ως εκ τούτου συμμετέχει στη λευχαιμογένεση. Κυρίως όμως η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι, τα κύτταρα του κλώνου της ΠΝΑ αν και ανευρίσκονται στα σύνδρομα ανεπαρκείας του μυελού των οστών, δεν είναι αυτά που επιλέγονται για την κλωνική εξέλιξη κατά την εκτροπή σε ΟΜΛ