Μελέτη της απόπτωσης υποπληθυσμών λευκοκυττάρων σε καρδιοχειρουργικούς ασθενείς

Abstract

Background: Cardiac surgery under cardiopulmonary bypass (CPB) induces a major postoperative systemic inflammatory response (SIRS) causing variations on apoptotic potential of leukocyte subpopulations. The purpose of this study is the qualitative and quantitative study of apoptosis in six leukocyte subpopulations [T (CD3+/CD4+) / T (CD3+/CD8+) / Β (CD19+) / NK (CD16+/56+) / CD14+ monocytes and CD16+ granulocytes], the study of expression of seven pro- and anti-apoptotic genes (BCLA2A1, BCL2L1, MCL1, BAX, BID, XIAP και BIRC3), the correlation of apoptosis with the levels of pro- and anti-inflammatory cytokines (IL-1b, Il-6, IL-7, IL-8, IL-10, sFasL και TNFa) and its prognostic value for the postoperative development of cardiac patients.Methods: We studied 56 patients undergoing various cardiac surgery procedures with cardiopulmonary bypass (CPB). Apoptotic cells were double stained with Annexin V and propidium iodide and then analyzed by flow cytometry method. Expression of pro- and anti-apoptotic genes was studied with microarrays’ analysis and use of quantitative RT-PCR. Serum cytokine levels were measured using Luminex-xMap method. Blood sampling carried out at the point of induction of anaesthesia (T0), immediately after surgery (T1), 6 h (T2), 24 h (T3) and 48 h postoperatively (T4).Results: Apoptosis in leukocyte subpopulations, except in the case of B-(CD19+) lymphocytes, inhibited immediately after surgery (T1) (p < 0.001) showing an increase at 24 hours postoperatively (T3) (p < 0.001) and a stabilization at 48 hours postoperatively (T4) (p < 0.001). Percentage of neutrophil apoptosis correlated negatively (Spearman’s ratio : -0,450) with its absolute number immediately after surgery (T1). Additionaly, there was a negative significant correlation between the percentage of neutrophil apoptosis at induction of anaesthesia (T0) and development of postoperative atrial fibrillation (Spearman’s ratio: - 0,469) in coronary patients. Expression of antiapoptotic gene BCL2A1 significantly increased immediately postoperatively (T1) in granulocytes and peripheral blood mononuclear cells (p = 0.008 and 0.021 respectively). Concentrations of inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 showed their peak value immediately postoperatively (T1) (p < 0.001), followed by a gradual postoperative decrease 24 h (T3) (p < 0.001) and 48h postoperatively (T4) (p < 0.001 and p = 0.022 respectively). Concentration of IL-10 showed its peak value 6 h postoperatively (T2) (p < 0.001), followed by a gradual postoperative decrease 24 h (T3) (p < 0.001) and 48h postoperatively (T4) (p < 0.001).Conclusions: Inhibition of apoptosis immediately after surgery (T1) was observed in the majority of leukocyte subpopulations, followed by gradual increase 24 h (T3) and 48 h (T4) postoperatively in values similar of those at the point of induction of anaesthesia. Preoperative percentage of neutrophil apoptosis could be a biomarker predicting the susceptibility of patient for the development of postoperative atrial fibrillation (POAF). Inhibition of apoptosis immediately postoperatively (T1) seems to be expressed by antiapoptotic gene BCL2A1. Levels of proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8 showed their peak value immediately postoperatively (T1), while concentration of anti-inflammatory cytokine IL-10 showed its maximum value 6 h postoperatively (T2).

Υπόθεση: Οι καρδιοχειρουργικές επεμβάσεις υπό εξωσωματική κυκλοφορία επάγουν μία μείζονα συστηματική φλεγμονώδη αντίδραση (SIRS) μετεγχειρητικά, προκαλώντας την μεταβολή των αποπτωτικών δυναμικών των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών. Σκοπός της εργασίας είναι η ποσοτική και ποιοτική μελέτη της απόπτωσης έξι λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών [T (CD3+/CD4+) / T (CD3+/CD8+) / Β (CD19+) / NK (CD16+/56+) / CD14+ μονοκύτταρα και CD16+ granulocytes], η μελέτη της έκφρασης επτά προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων (BCLA2A1, BCL2L1, MCL1, BAX, BID, XIAP και BIRC3), η συσχέτιση της απόπτωσης με τα επίπεδα των κυτοκινών (IL-1b, Il-6, IL-7, IL-8, IL-10, sFasL και TNFa) και η προγνωστική της αξία στην μετεγχειρητική εξέλιξη των καρδιοχειρουργικών ασθενών.Υλικό & Μέθοδοι: Μελετήθηκαν συνολικά 56 ασθενείς, οι οποίοι υποβλήθηκαν σε καρδιοχειρουργικές επεμβάσεις αορτοστεφανιαίας παράκαμψης, αντικατάστασης βαλβίδων και ανιούσης αορτής με τη χρήση εξωσωματικής κυκλοφορίας. Η μελέτη της απόπτωσης των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών έγινε με διπλή χρώση των κυττάρων με Aννεξίνη V και ιωδιούχο προπίδιο και ανάλυση με κυτταρομετρία ροής. Η μελέτη της έκφρασης των προ- και αντι-αποπτωτικών γονιδίων στα κοκκιοκύτταρα και στα μονοπύρηνα έγινε με ανάλυση μικροσυστοιχιών και χρήση ποσοτικής RT-PCR. Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης των κυτοκινών στον ορό έγινε με χρήση της μεθόδου Luminex-xMAP. Η αιμοληψία έλαβε χώρα αμέσως μετά την εισαγωγή του ασθενούς στην αναισθησία (Τ0), αμέσως μετά το τέλος της επέμβασης (Τ1), 6 ώρες (Τ2), 24 ώρες (Τ3) και 48 ώρες μετεγχειρητικά (T4). Οι μεταβολές της απόπτωσης των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών συσχετίστηκαν στατιστικά με ποικίλες προεγχειρητικές και μετεγχειρητικές κλινικές παραμέτρους.Αποτελέσματα: Η απόπτωση του συνόλου των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών, εκτός από τα Β-(CD19+) λεμφοκύτταρα, ανεστάλη άμεσα μετεγχειρητικά (T1) (p < 0.001) ενώ εμφάνισε αύξηση 24 ώρες (T3) (p < 0.001) και σταδιακή σταθεροποίηση 48 ώρες (Τ4) μετά το τέλος του χειρουργείου (p < 0.001). Το ποσοστό της απόπτωσης των ουδετεροφίλων άμεσα μετεγχειρητικά (Τ1) συσχετίζεται ισχυρά αρνητικά με την μεταβολή του απόλυτου αριθμού τους (Spearman’s ratio : -0,450). Επίσης, το ποσοστό των πρωτογενών αποπτωτικών ουδετεροφίλων, κατά την στιγμή της εισόδου στην αναισθησία (Τ0), συσχετίζεται ισχυρά αρνητικά με την πιθανότητα εμφάνισης μετεγχειρητικής κολπικής μαρμαρυγής (POAF) (Spearman’s ratio : -0,469). Παρατηρήθηκε ιδιαίτερα αυξημένη έκφραση του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2A1 άμεσα μετεγχειρητικά (Τ1) στα κοκκιοκύτταρα και στα μονοπύρηνα του περιφερικού αίματος (p = 0.008 και 0.021 αντίστοιχα). Τα επίπεδα της IL-6 και της IL-8 παρουσίασαν την μέγιστη συγκέντρωσή τους άμεσα μετεγχειρητικά (Τ1) (p < 0.001), με τις τιμές τους να μειώνονται αισθητά 24 (Τ3) (p < 0.001) και 48 ώρες μετά το τέλος της χειρουργικής επέμβασης (Τ4) (p < 0.001 και p = 0.022 αντίστοιχα). Τα επίπεδα της IL-10 εμφάνισαν την μέγιστη συγκέντρωσή τους 6 ώρες μετεγχειρητικά (Τ2) (p < 0.001) και μειώθηκαν αισθητά 24 (Τ3) (p < 0.001) και 48 ώρες μετεγχειρητικά (Τ4) (p < 0.001). Συμπεράσματα: Στο σύνολο των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών, εκτός από τα Β-(CD19+) λεμφοκύτταρα, παρατηρείται αναστολή της απόπτωσής τους άμεσα μετεγχειρητικά (Τ1) και σταδιακή επάνοδο στις τιμές της εισόδου στην αναισθησία 24 (Τ3) και 48 ώρες μετεγχειρητικά (Τ4). Το ποσοστό της απόπτωσης των ουδετεροφίλων κατά την εισαγωγή στην αναισθησία (Τ0) είναι δυνατόν να χρησιμεύσει ως βιοδείκτης με προγνωστική αξία για την εμφάνιση μετεγχειρητικής κολπικής μαρμαρυγής στους στεφανιαίους ασθενείς. Η αναστολή της απόπτωσης άμεσα μετεγχειρητικά φαίνεται να λαμβάνει χώρα κυρίως διαμέσου της αυξημένης έκφρασης του αντιαποπτωτικού γονιδίου BCL2A1. Τα επίπεδα των προφλεγμονωδών κυτοκινών IL-6 και IL-8 εμφάνισαν την μέγιστη συγκέντρωσή τους άμεσα μετεγχειρητικά (T1), σε αντίθεση με την συγκέντρωση της αντιφλεγμονώδους κυτοκίνης IL-10 που εμφάνισε την μέγιστη τιμή της 6 ώρες μετεγχειρητικά. Η απόπτωση των λευκοκυτταρικών υποπληθυσμών ενδεχομένως να έχει προγνωστική αξία για την μυοκαρδιακή βλάβη μετά από καρδιοχειρουργικές επεμβάσεις με εξωσωματική κυκλοφορία καθώς και για τη συνολική απώλεια αίματος μετεγχειρητικά στους καρδιοχειρουργικούς ασθενείς. Οι διαβητικοί ασθενείς φαίνεται ότι παρουασιάζουν διαταραχή του αποπτωτικού δυναμικού των μονοκυττάρων.