Ανίχνευση φορέων νοτιαίας μυϊκής ατροφίας με ποσοτικό PCR στο γενικό πληθυσμό

Abstract

Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most common autosomalrecessive disorders worldwide: the carrier frequency is between 1/40 and 1/60in diverse populations and it affects 1 in 10 000 live births. SMA is caused bythe degeneration of anterior horn cells of the spinal cord, which leads tosymmetric proximal muscle weakness and atrophy. Based on the age at onsetand the clinical course, SMA is subdivided into three types: type I is aninfantile acute form and shows the greatest severity; type II is an infantilechronic form with intermediate severity and type III is a childhood andadolescent form and shows the mildest severity.All three types of SMA are linked mostly to the survival motor neuron (SMN)gene at 5q13, which is found as two nearly identical copies: SMN1 andSMN2. Mutations in the telomeric copy of the SMN gene (SMN1) areresponsible for SMA, whereas SMN2 functions as a disease-modifying genethat can ameliorate the clinical severity of SMA in a copy-dependent manner.Each SMN gene encompasses 27 kb and comprises of 9 exons (exons 1, 2a,2b, and 3–8). Typically, the DNA sequence of SMN1 differs from that of SMN2by only five nucleotides: One in intron 6, one in exon 7, two in intron 7, andone in exon 8. Of the SMA patients whose disorder is linked to 5q13, ∼96%are characterized by a homozygous deletion of SMN1 exon 7, which resultsfrom unequal crossover or SMN1-to-SMN2 conversion events. The remaining4% of cases are caused either by compound heterozygosity, with a point mutation in one allele and a deletion in the other, or by compoundheterozygous point mutations in the SMN1 gene.Given that homozygous deletion of exon 7 of SMN1 is a common genotypeand SMN2 can influence the severity of SMA, it is fundamentally important todirectly determine the copy numbers of SMN1 and SMN2 for carrier screeningand clinical/prenatal diagnosis of SMA. Using quantitative analysis ofSMN1/SMN2 gene dosage, a range of molecular investigations of theincidence of carriers and the genetic burden of SMA in diverse ethnicpopulations have been carried out. However, a population-based study ofSMA prevalence in Greece has not yet been executed. To estimate the futureburden of SMA and the requirements for its appropriate treatment,management and prevention in the Greek population, accurate populationfrequency data are essential. Such data could be obtained through thegenotyping of SMN genes in a large number of samples.In the study reported herein, we determined SMN copy number in 156 DNAsamples and from 44 core families with individuals with SMA, using Multiplexligation dependent probe amplification (MLPA), which has been proven to bea highly efficient and reliable carrier-screening test. The frequency of SMAcarriers in our population appears to be 1 in 52, which indicates that theprevalence of SMA among Greeks is the same as that among individuals inthe Western countries. We anticipate that our research will provide a basis fora nationwide program of clinical/prenatal diagnosis to prevent SMA in Greece.

Η νωτιαία μυϊκή ατροφία (SMA: Spinal Muscular Atrophy, SMA) αποτελεί μία από τις πιο συχνές αιτίες βρεφικής θνησιμότητας οφειλόμενη σε γενετικούς παράγοντες και είναι το δεύτερο σε συχνότητα νόσημα στην Ευρώπη που κληρονομείται με αυτοσωμικό υπολειπόμενο τρόπο, μετά την ινοκυστική νόσο. H νόσος εμφανίζεται στη βιβλιογραφία με συχνότητα ασθενών 1/6000 έως και 1/10000 και συχνότητα φορέων περίπου 1/45. Το νόσημα αποτελεί μια σοβαρή νευρομυϊκή πάθηση που οφείλεται σε εκφυλισμό των προσθίων κεράτων των κινητικών νευρώνων, γεγονός που προκαλεί προοδευτική ατροφία των εγγύς μυών, παράλυση, και αναπνευστική ανεπάρκεια. Οιασθενείς ανάλογα με την ηλικία έναρξης της ασθένειας, την κλινική βαρύτητα και το χρόνο επιβίωσης, κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: Τον τύπο Ι(Werdnig-Hoffmann, ΜΙΜ: 253300) με την βαρύτερη κλινική εικόνα και με χρόνο επιβίωσης έως και τα δύο έτη, τον τύπο ΙΙ (ΜΙΜ: 253400) με ενδιάμεση βαρύτητα και ηλικία έναρξης μέχρι τους 18 μήνες και το τύπο ΙΙΙ (Kugelberg-Welander, ΜΙΜ: 2534000) με την ηπιότερη εικόνα και ηλικία έναρξης μετά τους 18 μήνες.Οι τρεις κλινικές μορφές της νόσου, οφείλονται στο 95% των περιπτώσεων σε ομόζυγη έλλειψη στο γονίδιο SMN1 (Survival motor Neuron Gene 1, MIM#600354) το οποίο εντοπίζεται στη χρωμοσωμική περιοχή 5q13. Στην ίδιαχρωμοσωμική περιοχή εντοπίζεται το γονίδιο SMN2 (ΜΙΜ# 601627) που διαφέρει από το SMN1 μόνο σε 5 βάσεις από τις οποίες οι 2 εντοπίζονται στο εξώνια 7 και 8 και στις οποίες διαφορές βασίζεται η ανάλυση DNA για το διαχωρισμό των δύο γονιδίων. Οι τεχνικές διάγνωσης της νόσου βασίζονται στην εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR: polymerasechain reaction) και περαιτέρω διάκριση των προϊόντων SMN1 και SMN2 με τη χρήση περιοριστικών ενζύμων. Εξαιτίας της βαρύτητας της νόσου αλλά και της μεγάλης συχνότητας φορέων για ένα γενετικό νόσημα η ανίχνευση φορέων στο γενικό πληθυσμό αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την πρόληψη του νοσήματος και τη γενετική καθοδήγηση. Επιπλέον το γεγονό ςότι στην πλειονότητα των περιπτώσεων ανιχνεύεται μία μόνο γονιδιακή μετάλλαξη που είναι η ομόζυγη έλλειψη των εξωνίων 7 και 8 του γονιδίουSMN1, οδήγησε σε προσπάθειες ποσοτικής εκτίμησης των αντιγράφων του γονιδίου. Κάθε ασθενής με SMA διατηρεί όμως και ένα τουλάχιστον ομόλογο αντίγραφο SMN2 γεγονός που δυσκολεύει την ανίχνευση ετεροζυγωτών. Το ομόλογο γονίδιο SMN2, αν και μεταφράζεται, εξαιτίας μιας σημειακής μετάλλαξης στο εξώνιο 7 κωδικοποιεί mRNA με παράλειψη του εξωνίου 7 καιως εκ τούτου η παρουσία του δεν προκαλεί νόσο.Από το 1995 που ταυτοποιήθηκε το γονίδιο SMN1 έχουν αναπτυχθεί μια σειρά πρωτοκόλλων για την ανίχνευση φορέων που όμως τα περισσότερα περιλαμβάνουν πολύπλοκα βήματα με πιθανότητα σφάλματος για το καθένα εξ αυτών και ως εκ τούτου απαιτείται η καθιέρωση ενός έγκυρου τρόπου ανίχνευσης φορέων. Πρόσφατα αναφέρονται αυτοματοποιημένη προσέγγιση στην ανίχνευση φορέων (ανίχνευση έλλειψης σε ετεροζυγωτία) με την εφαρμογή σύγχρονων μεθοδολογιών βασισμένα σε αυτοματοποιημένη ανάλυση όπως είναι η τεχνική DHPLC (Denaturing High Performance Liquid Chromatography), Real Time PCR και πρόσφατα η τεχνική MLPA (MultipleLigation-Probe Amplification). Στην προτεινόμενη εργασία εφαρμόστηκαν και συγκρίθηκαν δύο προσεγγίσεις για την ποσοτική εκτίμηση των αντιγράφων SMN α) με τη χρήση ενός εσωτερικού δείγματος ελέγχου που σχεδιάστηκε ειδικά για τη μελέτη με ανάλυση σε αυτόματο αναλυτή και β) εφαρμογή της τεχνικής MLPAσυγκρίνοντας και τα δύο εμπορικά προϊόντα που συστήνονται για την ανίχνευση φορέων στην SMA (P021 και P061, SALSA MRC, Holland). Οι τεχνικές εφαρμόστηκαν σε άτομα υποχρεωτικούς φορείς της νόσου (γονείς που απέκτησαν πάνω από ένα παιδί με νόσο SMA) και στη συνέχεια η τεχνική που επιλέχθηκε εφαρμόστηκε σε 156 άτομα του γενικού πληθυσμού.Τα αποτελέσματα της μελέτης έδειξαν ότι η τεχνική MLPA υπερτερεί του απλού συγκριτικού ελέγχου με ένα εσωτερικό προϊόν το οποίο εμφανίζει ως κυριότερο μειονέκτημα τη μη επαναληπτικότητα, εξαιτίας κυρίως της ευαισθησίας που εμφανίζει ως προς το υπόστρωμα (DNA) που πολλαπλασιάζεται. Επίσης τo εμπορικό σύστημα P021 εμφανίζεται να υπερτερεί του προϊόντος P061, διότι δίνει χρήσιμες πληροφορίες που αφορούν και τον αριθμό των αντιγράφων SMN2 τα οποία επηρεάζουν τη βαρύτητα της νόσου.Η διερεύνηση φορείας στο γενικό πληθυσμό αποκάλυψε 3 φορείς έλλειψης των εξωνίων 7 και 8 σε 156 άτομα μη συγγενικά μεταξύ τους από όλη την Ελλάδα (1,93%), ποσοστό που πλησιάζει τα αντίστοιχα που αναφέρονται στη βιβλιογραφία για τους καυκάσιους πληθυσμούς. Επειδή η ίδια τεχνική εφαρμόστηκε και σε 96 γονείς ασθενών προέκυψε ότι η κατανομή των φορέων είναι τυχαία σε όλη την Ελλάδα με μικρές εξαιρέσεις για τα νησιά της Κεφαλονιάς, Ικαρίας και Κρήτης όπου εμφανίζεται μεγαλύτερη συγκέντρωση φορέων. Από τη μελέτη προέκυψε επίσης ότι το ποσοστό πολλαπλών αντιγράφων για το γονίδιο SMN1 είναι 4,6%, γεγονός που μειώνει την ασφάλεια αποτελέσματος. Από την ανίχνευση φορέων στα δείγματα των γονέων προέκυψαν 2 άτομα σε διαφορετικές οικογένειες, γεγονός που υποδηλώνει ότι σε ποσοστό <2% που αναφέρεται τουλάχιστον στη βιβλιογραφία υπάρχουν και de novo ελλείψεις οι οποίες διαφεύγουν του ελέγχου φορείας (γαμετικός μωσαϊκισμός ή de novo μεταλλάξεις).Επίσης έγινε προσπάθεια για πρώτη φορά στην Ελλάδα μιας πρώτης καταγραφής της συχνότητας των φορέων και του νοσήματος. Με τον τρόπο αυτό αναδεικνύεται η αναγκαιότητα του γενετικού ελέγχου σε ζευγάρια Ελλήνων πριν την τεκνοποίηση, έτσι ώστε ο προληπτικός γενετικός έλεγχος να οδηγήσει στην μείωση της συχνότητας γέννησης παθολογικών παιδιών.Σημειώνεται ότι για την Ελλάδα η νωτιαία μυϊκή ατροφία αποτελεί το τρίτο σε συχνότητα μονογονιδιακό υπολειπόμενο νόσημα και ήδη για τα άλλα δύο, τη μεσογειακή αναιμία και την ινοκυστική νόσο υπάρχει δυνατότητα ελέγχου των φορέων από κρατικές υπηρεσίες υγείας.