Στρεσογόνες επιδράσεις της νεφρικής ανεπάρκειας στα ώριμα ερυθροκύτταρα

Abstract

End stage renal disease (ESRD) patients exhibit a baseline profile of blood modifications, developed around a pathophysiological core of anemia, uremia, inflammation and oxidative stress. There is however, a huge inter-patient variability in numerous measures of red blood cell (RBC) and blood homeostasis, related in part to the administration of widely variable erythropoietin doses. Dialysis therapy, on the other hand, exerts additional stimuli on cells. Haemodiafiltration (HDF) is a renal replacement therapy which is based on the principles of diffusion and convection. It is generally thought to be more effective than conventional haemodialysis (cHD) in eliminating uremic toxins and in improving anemia; however, its effects on red blood cell (RBC) physiological features have not been examined in depth. This study assesses the physiological profile of RBCs in patients with ESRD receiving standard or high doses of recombinant human erythropoietin (rhEPO) as well as the effects of hemodiafiltration versus conventional hemodialysis in hematologic profile and RBC physiology.Blood samples from twenty-eight patients under sustained conventional hemodialysis, responsive, or not to standard rhEPO administration and thirty-two patients under regular HDF or cHD treatment were examined for haematological and RBC-related parameters compared to healthy donors. Red blood cells and plasma were studied for RBC morphology, fragility, hemolysis, redox status, removal signaling, membrane protein composition, and microvesiculation, in repeated paired measurements accomplished before and right after each dialysis session. Acute effects of uremic plasma on RBC features were examined in vitro through reconstitution experiments.Overall, the ESRD RBCs were characterized by pathological levels of shape distortions, surface removal signaling, and membrane exovesiculation, but reduced fragility compared to healthy RBCs. Irreversible transformation of RBCs was found to be a function of baseline Hb concentration. The more toxic uremic context in non-responsive patients compared to rhEPO responders was blunted in part by the antioxidant, anti-hemolytic, and anti-apoptotic effects of high rhEPO doses, and probably, of serum uric acid. A selective lower expression of RBC membrane in complement regulators (CD59, clusterin) and of CD47 “marker-of- self” was detected in non-responders and responders, respectively. Evidence for different short-term dialysis effects and probably for a different erythrocyte vesiculation mechanism in rhEPO responsive compared to non-responsive patients was also revealed. Regarding dialysis therapy effects, HDF-group of patients was characterized by better anemic indexes, improved redox potential and suppressed exovesiculation of blood cells compared to cHD-group pre-dialysis. However, HDF was associated with a temporary but acute, oxidative stress-driven adverse effect on RBCs, reflected by appearance of haemolysis, removal signaling and stomatocytosis.Conclusively, deregulation of RBC homeostasis might involve diverse molecular pathways driving erythrocyte signaling and removal in rhEPO non-responders compared to responsive patients. Moreover, HDF has beneficial “long-term” effects over cHD on ESRD in respect to anemia and RBC physiology. The adverse short-term effects of HDF on postdialysis plasma and RBCs, which are probably associated with the effective clearance of natural antioxidant components from the uremic plasma, strongly suggest the use of a parallel antioxidant therapy during the dialysis session.

Τα ερυθροκύτταρα των ασθενών με χρόνια νεφρική ανεπάρκεια (ΧΝΑ) τελικού σταδίου που υποβάλλονται σε θεραπεία αιμοκάθαρσης παρουσιάζουν σημαντικές μεταβολές τόσο στο αιματολογικό πρότυπο σε σχέση με υγιή άτομα όσο και σε χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων σε επίπεδο οξειδωτικού στρες, μορφολογίας, ερυθρόπτωσης, πρωτεϊνικής σύστασης καθώς και αλλαγές σε χαρακτηριστικά του πλάσματος. Η ανθεκτικότητα στην ερυθροποιητίνη έχει συσχετισθεί με ερυθροκυτταρικές βλάβες χωρίς όμως να έχει μελετηθεί ενδελεχώς αυτός ο μηχανισμός αλληλεπίδρασης. Όσον αφορά στην αιμοκάθαρση, εκτός από τη σημαντική επίδραση που έχει στο προσδόκιμο ζωής των ασθενών με ΧΝΑ και στην αντιμετώπιση της αναιμίας, έχει σημαντική επίδραση και σε χαρακτηριστικά των ερυθροκυττάρων τα οποία σχετίζονται με την εμφάνιση αναιμίας.Στόχος της παρούσας μελέτης υπήρξε η λεπτομερής ανάλυση σε κυτταρικό επίπεδο των ερυθροκυττάρων και του πλάσματος ασθενών με ΧΝΑ τελικού σταδίου υπό συμβατική αιμοκάθαρση οι οποίοι λαμβάνουν πολύ υψηλές δόσεις ερυθροποιητίνης σε σύγκριση με ασθενείς που λαμβάνουν φυσιολογικές δόσεις, με απώτερο στόχο την εύρεση των τροποποιήσεων που προκύπτουν ως αποτέλεσμα της περίσσειας ερυθροποιητίνης στο αίμα των ασθενών. Επιπλέον, μελετήθηκε η επίδραση μιας σχετικά νέας μεθόδου κάθαρσης, της αιμοδιαδιήθησης, σε σχέση με τη χρόνια εφαρμοζόμενη συμβατική αιμοκάθαρση για την εύρεση των επιδράσεων αυτής της μεθόδου στο βαθμό αναιμίας των ασθενών, μέσα από τη μελέτη του αιματολογικού προτύπου αλλά και χαρακτηριστικών των ερυθροκυττάρων και του πλάσματος.Εκτός από τον κλασσικό αιματολογικό και βιοχημικό έλεγχο, στο πλάσμα μετρήθηκε η ολική αντιοξειδωτική ικανότητα με δοκιμασία αναγωγής τρισθενούς σιδήρου (FRAP assay), η ελεύθερη αιμοσφαιρίνη (αιμόλυση) κατά Harboe καθώς και ο πληθυσμός των ολικών και ερυθροκυτταρικών μικροκυστιδίων με κυτταρομετρία ροής. Στα ερυθροκύτταρα, η μορφολογική εκτίμηση έγινε με Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης, η πρωτεϊνική σύσταση της ερυθροκυτταρικής μεμβράνης με ανοσοαποτύπωμα κατά Western, η μέτρηση των ενδοκυττάριων επιπέδων ROS και ιόντων ασβεστίου διενεργήθηκε με φθορισμομετρία και τα επίπεδα εξωτερίκευσης φωσφατιδυλοσερίνης ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Επιπλέον, στα ερυθροκύτταρα πραγματοποιήθηκε μέτρηση της οσμωτικής και μηχανικής ευθραυστότητας. Η άμεση επίδραση του ουραιμικού πλάσματος στα ερυθροκύτταρα μελετήθηκε in vitro με πειράματα ανασύστασης. Ακολούθησε στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων και ανάλυση δικτύων.Γενικά, τα ουραιμικά ερυθροκύτταρα χαρακτηρίζονται από παθολογικές μορφολογικές τροποποιήσεις, δείκτες απομάκρυνσης από την κυκλοφορία και αυξημένα επίπεδα κυστιδιοποίησης. Μάλιστα, τα επίπεδα των μη αναστρέψιμων μορφολογικών τροποποιήσεων επηρεάζονται σε κάποιο βαθμό από τα επίπεδα αιμοσφαιρίνης αίματος των ασθενών. Η μειωμένη ανταπόκριση στη θεραπεία με ερυθροποιητίνη σχετίζεται μεαυξημένα επίπεδα ουραιμικών τοξινών στο πλάσμα, ανεπάρκεια πρωτεϊνών CD59 και κλαστερίνη, αυξημένη πρόσδεση της υπεροξειρεδοξίνης-2 στη μεμβράνη ενώ η αιμοκάθαρση επιφέρει σημαντική αύξηση των επιπέδων εξωτερίκευσης φωσφατιδυλοσερίνης. Αντίθετα, η ανταπόκριση στη θεραπεία σχετίζεται με παθολογικάυψηλή αιμόλυση, μειωμένη ανθεκτικότητα στο μηχανικό στρες, αυξημένη πρόσδεσηανοσοσφαιρινών G στη μεμβράνη και ανεπάρκεια του μορίου CD47, ενώ η διαδικασία της αιμοκάθαρσης οδηγεί σε σημαντική αναδιαμόρφωση της μεμβράνης. Όσον αφορά στη μελέτη των δύο διαφορετικών μεθόδων κάθαρσης, η χρόνια θεραπεία σε αιμοδιαδιήθηση οδηγεί σε αποτελεσματική αντιμετώπιση της αναιμίας, βελτίωση του οξειδοαναγωγικού δυναμικού των ερυθροκυττάρων και καταστολή της κυστιδιοποίησης σε σχέση με τη συμβατική αιμοκάθαρση. Αντίθετα, οι άμεσες επιδράσεις της αιμοδιαδιήθησης περιλαμβάνουν αύξηση του οξειδωτικού στρες, παθολογική αιμόλυση, αύξηση δεικτών απομάκρυνσης από την κυκλοφορία και εμφάνιση στοματοκυττάρωσης.Συμπερασματικά, το περισσότερο τοξικό ουραιμικό περιβάλλον που χαρακτηρίζει τους μη ανταποκρινόμενους ασθενείς σε σχέση με τους ανταποκρινόμενους, αντιμετωπίζεται εν μέρει από τις αντιοξειδωτικές, αντι-αιμολυτικές και αντι-αποπτωτικές ιδιότητες της ευθροποιητίνης και του ουρικού οξέος. Η αναιμία στους μη ανταποκρινόμενους ασθενείς φαίνεται να σχετίζεται κυρίως με ανεπάρκεια πρωτεϊνών που αναστέλουν την ενεργοποίηση του συμπληρώματος, ενώ στους ανταποκρινόμενους με επιταχυνόμενο φαινότυπο γήρανσης και αυξημένη ερυθροφαγοκυττάρωση. Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις για διαφορετικό μηχανισμό κυστιδιοποίησης των ερυθροκυττάρων ανάμεσα στις δύο ομάδες των ασθενών. Αντίστοιχα, η θεραπεία σε αιμοδιαδιήθηση μακροπρόθεσμα οδηγεί σε βελτίωση της αναιμίας και των ερυθροκυτταρικών παραμέτρων σε σχέση με τη συμβατική αιμοκάθαρση. Οι αρνητικές επιπτώσεις που παρατηρούνται μετά το τέλος της συνεδρίας κάθαρσης στην αιμοδιαδιήθηση φαίνεται να σχετίζονται με την απώλεια χρήσιμων αντιοξειδωτικών συστατικών του αίματος ταυτόχρονα με την απομάκρυνση των ουραιμικών τοξινών. Η θεραπεία με αντιοξειδωτικά φάρμακα κατά τη διάρκεια της συνεδρίας ή η χρήση κατάλληλων φίλτρων εμπλουτισμένων σε βιταμίνες θα μπορούσε να αναστείλλει τις αρνητικές επιπτώσεις που έχει, έστω και προσωρινά, η θεραπεία της αιμοδιαδιήθησης.