Απεικονιστική και βιοχημική διερεύνηση των ολιγοσακχαριτών και πολυσακχαριτών του υαλουρονικού οξέος κατά την παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και τη ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς

Abstract

Purpose: To evaluate the possible role of Hyaluronan (HA) fragments in the pathogenesis of Proliferative Diabetic Retinopathy (PDR) and Rhegmatogenous Retinal Detachment (RRD). Materials and Methods: Two case-control studies were conducted. The first group of patients involved patients with PDR. The second group of patients consisted of patients with RRD. The control group was common for the two patients groups and was formed by patients with unrelated diseases. All patients consented for the acquisition of vitreous samples during the vitrectomy procedure. Agarose gel electrophoresis was used to evaluate HA molecular weight. Enzyme-linked binding protein assay was used to estimate HA concentration in the vitreous samples. Finally, evaluation of hyaluronidase activity was performed using SDS-PAGE. Statistical analysis was performed using SPSS 17.0 for Windows. Results: Overall, 38 patients with PDR, 20 patients with RRD and 19 controls participated in this study. These three groups were similar concerning both the age (F(2,74)=1.86, p=0.16) and the gender of the patients (x2=3.17, p=0.205).In the vitreous of the controls only very high molecular weight polysaccharides of HA were detected (2x103-3x103 kDa). In addition, in this group fragments with progressively lower molecular mass were detected with aging. In contrast, in the PDR group oligosaccharides with significantly lower molecular weight were present. Furthermore, in both of the patients group an age-related pattern of HA fluctuation was absent. HA concentration was 271.81(143.63) μg/ml in the control group, 223.80(129.50) μg/ml in the PDR group and 50.96(28.36) μg/ml in the RRD group. The mean concentration of HA differed significantly between the RRD and the control group (t=6.74, p<0.0005). A strong, positive and statistically significant correlation was detected between HA concentration and the duration of diabetes in the PDR group (r=0.7, n=38, p<0.0005). SDS-PAGE revealed significantly higher hyaluronidase activity in the vitreous of the RRD patients as compared to the controls (t=2.31, p=0.037). Discussion: In healthy individuals it seems that normal ageing is characterized by a progressive degradation of HA polysaccharides in the vitreous body. However, this does not seem to apply under pathological conditions such as PDR and RRD.In contrast, the hyperglycemia-induced oxidative stress in the vitreous cavity of patients with diabetes seems to exacerbate the partial degradation of HA, resulting in the formation of fragments that, at least at a molecular level, are able to promote the angiogenic process.On the other hand, the vitreous of RRD patients is characterized by increased hyaluronidase enzymatic activity. This seems to result in the total degradation of HA in the vitreous. The subsequent destabilization of the vitreous body may result in the development of abnormal traction forces into the vitreous cavity, which when exerted upon the retina could result to retinal tears formation and potentially to retinal detachment.

Σκοπός: Η εκτίμηση του ρόλου που ενδεχομένως διαδραματίζουν τα σάκχαρα του υαλουρονικού οξέος στην παθογένεια αφ’ ενός της παραγωγικής διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας και αφ’ ετέρου της ρηγματογενούς αποκόλλησης του αμφιβληστροειδούς. Υλικό και Μέθοδος: Διενεργήθηκαν δύο μελέτες ασθενών-ομάδας ελέγχου. Η πρώτη ομάδα ασθενών περιελάμβανε ασθενείς με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια. Η δεύτερη ομάδα ασθενών συγκροτήθηκε από ασθενείς με ρηγματογενή αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Η ομάδα ελέγχου ήταν κοινή και συγκροτήθηκε από ασθενείς με μη σχετιζόμενες διαταραχές. Από όλους τους ασθενείς έγινε λήψη δείγματος υαλοειδούς κατά τη διάρκεια της υαλοειδεκτομής, μετά από συγκατάθεσή τους. Το μοριακό βάρος του υαλουρονικού οξέος στο υαλοειδές εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης. Η μέτρηση της συγκέντρωσης του υαλουρονικού οξέος έγινε με συνδεδεμένη με ένζυμο δοκιμασία σύνδεσης πρωτεΐνης. Τέλος, η εκτίμηση της δραστικότητας της υαλουρονιδάσης στο υαλοειδές έγινε με SDS ηλεκτροφόρηση σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του στατιστικού πακέτου SPSS 17.0. Αποτελέσματα: Συνολικά συμμετείχαν 38 ασθενείς με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια, 20 ασθενείς με ρηγματογενή αποκόλληση αμφιβληστροειδούς και 19 μάρτυρες. Οι τρεις ομάδες δε διέφεραν σημαντικά όσον αφορά στην ηλικία των ασθενών (F(2,74)=1,86, p=0,16) ή στο φύλο (x2=3,17, p=0,205).Στο υαλοειδές των μαρτύρων διαπιστώθηκαν αποκλειστικά υψηλού μοριακού βάρους πολυσακχαρίτες του υαλουρονικού οξέος (2x103-3x103 kDa). Επίσης, στην ομάδα αυτή διαπιστώθηκε ότι προϊούσης της ηλικίας παρατηρούνται πολυσακχαρίτες του υαλουρονικού οξέος με προοδευτικά χαμηλότερη μοριακή μάζα. Αντιθέτως, στους ασθενείς με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια παρατηρήθηκε η παρουσία σημαντικά μικρότερων κλασμάτων. Επιπροσθέτως, και στις δύο ομάδες ασθενών απουσίαζε οποιοδήποτε πρότυπο μεταβολής του μοριακού βάρους του υαλουρονικού οξέος με την ηλικία. Η συγκέντρωση του υαλουρονικού οξέος ήταν 271,81(143,63) μg/ml στην ομάδα των μαρτύρων, 223,80(129,50) μg/ml στους ασθενείς με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και 50,96(28,36) μg/ml στους ασθενείς με αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Στατιστικά σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ των ασθενών με αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς και των μαρτύρων (t=6,74, p<0,0005).Στους ασθενείς με παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια διαπιστώθηκε ισχυρή, θετική και στατιστικώς σημαντική συσχέτιση μεταξύ της διάρκειας του σακχαρώδη διαβήτη και των επιπέδων του υαλουρονικού οξέος (r=0,7, n=38, p<0,0005). Η ζυμογραφία σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου κατέδειξε ότι το υαλοειδές των ασθενών με αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς παρουσίαζε σημαντικά μεγαλύτερη δραστικότητα υαλουρονιδάσης σε σύγκριση με το υαλοειδές των μαρτύρων (t=2,31, p=0,037). Συζήτηση: Κάτω από φυσιολογικές συνθήκες φαίνεται ότι η γήρανση χαρακτηρίζεται από προοδευτική ελάττωση του μεγέθους των πολυσακχαριτών του υαλουρονικού οξέος στο υαλοειδές. Κάτι τέτοιο, ωστόσο, δε φαίνεται να ισχύει κάτω από παθολογικές καταστάσεις, όπως η παραγωγική διαβητική αμφιβληστροειδοπάθεια και η ρηγματογενής αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς. Αντιθέτως, το οξειδωτικό stress που παρατηρείται, συνέπεια της υπεργλυκαιμίας, στην υαλοειδική κοιλότητα των διαβητικών ασθενών φαίνεται ότι σχετίζεται με μερικό αποπολυμερισμό του υαλουρονικού οξέος και σχηματισμό ολιγοσακχαριτών, οι οποίοι, σε κυτταρικό τουλάχιστον επίπεδο είναι ικανοί να προάγουν τη διαδικασία της νεοαγγείωσης. Παράλληλα, η αυξημένη δραστικότητα υαλουρονιδάσης που παρατηρείται στο υαλοειδές ασθενών με αποκόλληση του αμφιβληστροειδούς φαίνεται ότι έχει ως αποτέλεσμα την ελάττωση των επιπέδων του υαλουρονικού οξέος στο υαλοειδές. Η επακόλουθη αποσταθεροποίηση του υαλώδους σώματος οδηγεί στην ανάπτυξη ελκτικών δυνάμεων εντός της υαλοειδικής κοιλότητας, οι οποίες είναι δυνατό να καταλήξουν στη δημιουργία ρωγμών στον αμφιβληστροειδή και τελικά στην αποκόλλησή του.