Μοριακές μελέτες κατά την επίδραση της προχορήγησης του σεβοφλουράνιου στην ηπατική και πνευμονική βλάβη από ισχαιμία/επαναιμάτωση ήπατος σε μοντέλο αρουραίων

Abstract

Sevoflurane has been shown to improve ischemia/reperfusion injury (IRI) through several mechanisms, including amelioration of inflammatory response. However, there haven’t been any studies considering the potential role of the complement system in sevoflurane-mediated amelioration of ischemia/reperfusion injury. Our purpose was to investigate the molecular mechanisms of the inflammation involved in sevoflurane preconditioning in liver and lung injury induced by liver ischemia-reperfusion (LIR). For this purpose, fifty male Wistar rats were randomly allocated in five groups (n=10 each): Animals in group LIR received ketamine and xylazine and were then subjected to ischemia of the right and median hepatic lobe for 45 min and reperfusion for 6 h. Group SEVO/LIR also received anesthesia with ketamine and xylazine and additionally, animals received sevoflurane for 30 min. and then LIR was induced, as in group LIR. Animals in group SHAM/LIR were anesthetized with ketamine and xylazine and then laparotomy followed. Group SHAM/SEVO received anesthesia with sevoflurane for 30 min. and then laparotomy followed. Finally, in group VEN, animals only received ketamine and xylazine.Afterwards, bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was obtained to measure cell counts. Liver function parameters and plasma complement C3 levels in serum were determined. Histologic changes both in liver and lung and CASP3 and ICAM1 deposition in those tissues sections were examined. Expression of complement C3 and C5 mRNA, along with ICAM1 and CLU mRNA was analyzed by quantitative real-time –PCR.Our study showed that sevoflurane preconditioning significantly improved liver-function tests (decreased ALT, AST and ALP levels) and limited inflammatory cell infiltration in BALF. Additionally, compared with the LIR group, the plasma C3 levels, were significantly reduced in the SEVO/LIR group. No stastically significant differences were observed in histological examination in the liver and lung. Immunostaining of the liver for ICAM1 however, showed a decrease in the membranse isoform of ICAM1 in the SEVO/LIR group. In the lung, sevoflurane seemed to exert no effect in ICAM1 levels. CASP3 levels in the liver and the lung also appeared unaffected by sevoflurane preconditioning. In the SEVO/LIR group, ICAM1 mRNA levels were found significantly decreased in the liver. No statistical significantly differences were observed in C3, C5 and CLU mRNA levels in any tissue.Summarising, sevoflurane preconditioning seems to ameliorate LIR-induced inflammatory injury both in the liver and in the lung, mediated, at least partially, by the C3 and ICAM-1 molecules. Further studies are needed to shed light into the underlying mechanisms and the potential of the application of sevoflurane preconditioning in the clinical praxis.

Το σεβοφλουράνιο έχει δειχθεί ότι βελτιώνει τη βλάβη από ισχαιμία/επαναιμάτωση (ischemia/reperfusion injury, IRI) μέσω διαφόρων μηχανισμών, οι οποίοι περιλαμβάνουν τη μείωση της έκτασης της φλεγμονώδους διαδικασίας. Παρόλα αυτά, δεν υπάρχουν μέχρι στιγμής μελέτες σχετικά με τον ενδεχόμενο ρόλο του συστήματος του συμπληρώματος στον μεσολαβούμενο από σεβοφλουράνιο περιορισμό της IRI.Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να μελετηθούν οι μοριακοί μηχανισμοί της φλεγμονής που εμπλέκονται στην προχορήγηση του σεβοφλουράνιου στην ηπατική και πνευμονική βλάβη μετά από ισχαιμία/επαναιμάτωση ήπατος (liver ischemia-reperfusion, LIR). Για το σκοπό αυτό, 50 αρσενικοί αρουραίοι Wistar μοιράστηκαν τυχαία σε πέντε ομάδες (n=10 η καθεμία): Τα ζώα στην ομάδα LIR αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη και ξυλαζίνη και στην συνέχεια υποβλήθηκαν σε ισχαιμία του δεξιού και μέσου ηπατικού λοβού για 45 min και επαναιμάτωση για 6 h. Στα ζώα της ομάδας SEVO/LIR εκτός από την αναισθησία με κεταμίνη/ξυλαζίνη, χορηγήθηκε σεβοφλουράνιο για 30 min και ακολούθησε ισχαιμία/επαναιμάτωση ήπατος, όπως στην ομάδα LIR. Στην ομάδα SHAM/LIR τα ζώα αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη/ξυλαζίνη και στη συνέχεια διενεργήθηκε λαπαροτομή. Η ομάδα SHAM/SEVO περιελάμβανε αναισθησία με σεβοφλουράνιο για 30 min και στη συνέχεια λαπαροτομή. Τέλος, στην ομάδα VEN, τα ζώα έλαβαν μόνο κεταμίνη και ξυλαζίνη.Στη συνέχεια έγινε λήψη βρογχοκυψελιδικού εκπλύματος (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) για τον καθορισμό των κυτταρικών πληθυσμών. Επίσης, καθορίστηκαν οι παράμετροι ηπατικής λειτουργίας και τα επίπεδα του τρίτου συστατικού του συμπληρώματος, C3, στον ορό. Ακολούθως, μελετήθηκαν οι ιστολογικές διαφορές στο ήπαρ και στον πνεύμονα, καθώς και ο ιστολογικός εντοπισμός των πρωτεϊνών CASP3 και ICAM1 σε τομές των παραπάνω ιστών σε παραφίνη. Τέλος, μελετήθηκαν με τη μέθοδο της ποσοτικής RT- Real-Time PCR η έκφραση σε επίπεδο mRNA, των γονιδίων του συμπληρώματος C3 και C5, καθώς επίσης της ICAM1 και της CLU.Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι η προχορήγηση σεβοφλουράνιου βελτιώνει σημαντικά τις παραμέτρους ηπατικής λειτουργίας (μειώνοντας τα επίπεδα ALT, AST και ALP στον ορό) και περιορίζοντας τη διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων στο BALF. Επιπλέον, σε σύγκριση με την ομάδα LIR, η μείωση στα επίπεδα C3 του πλάσματος φάνηκε σημαντικά μειωμένη στην ομάδα SEVO/LIR. Στην ιστολογική εξέταση του ήπατος και του πνεύμονα δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην. Παρόλα αυτά, τα επίπεδα εντοπισμού της μεμβρανικής ισομορφής της ICAM1 στο ήπαρ, τα οποία εξετάστηκαν με τη μέθοδο της ανοσοϊστοχημείας, έδειξαν σημαντική μείωση στη ομάδα SEVO/LIR, σε σχέση με την ομάδα LIR. Στον πνεύμονα αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές. Τα επίπεδα εντοπισμού της CASP3, τόσο στον πνεύμονα, όσο και στο ήπαρ, φάνηκαν επίσης να μην επηρεάζονται από την προχορήγηση σεβοφλουράνιου. Στην ομάδα SEVO/LIR, τα επίπεδα της έκφρασης του mRNA της ICAM1 δείχθηκαν μειωμένα στο ήπαρ. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση των mRNA των γονιδίων του συμπληρώματος C3, C5 και CLU στο ήπαρ ή στον πνεύμονα.Συνοψίζοντας, η προχορήγηση σεβοφλουράνιου φαίνεται να μειώνει τη φλεγμονώδη βλάβη που επάγεται από τη LIR, τόσο στο ήπαρ, όσο και στον πνεύμονα, το οποίο φαίνεται να μεσολαβείται, μερικώς τουλάχιστον, από το C3 και την ICAM-1. Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για τη διευκρίνηση των υποκείμενων μηχανισμών, καθώς και για τη διερεύνηση της δυνατότητας εφαρμογής της προχορήγησης σεβοφλουράνιου στην κλινική πράξη.