Διερεύνηση της μηχανικής συμπεριφοράς οστεοβλαστών κατά την προσκόλλησή τους σε υποστρώματα φυσικών βιοϋλικών

Abstract

The understanding of the phenomena that take place during cell-biomaterial interactionand the correlation of cell mechanical parameters with complicated processes at theextracellular environment (ECM) is driving the future of biomaterial design.The aim of the present study was the investigation of attachment and of alterations ofmechanical properties of osteoblasts during the initial phase of attachment on chitosanbiopolymer substrate.The preparation of the chitosan substrates was done with covalent immobilization of thebiopolymer on glass surface (control substrate). X-Ray photolelectron spectroscopyconfirmed the alteration of the surface chemical composition. Mean surface roughness, asmeasured by Atomic Force Microscopy, was increased 4-fold compared to glass, while themean contact angle was found 3 times higher on chitosan substrate.The mean number and spreading area of the attached cells, were determined by ScanningElectron Microscopy images and the use of image processing program. Up to 30 minutes,the number of attached cells was higher on chitosan, while after 45 minutes, it was on glass. At all time points, the mean spreading area was greater on chitosan.To quantify attachment, the micropipette aspiration technique was used at experiments ofdetachment of individual osteoblasts. The ‘’detachment impulse’’, I, was calculated, as theintegral of the applied force at time required (I=SFdt) for complete detachment of onecell, and it was found statistically higher on chitosan at all attachment times. With thequantified Polymerase Chain Reaction, the αν, α4, β1 and β3 gene integrin expression wasfound significantly increased from 30 to 120 minutes of attachment on chitosan. Usingconfocal scanning microscopy, higher expression of focal adhesion kinase was observedon chitosan at 30 and 120 minutes of attachment.Additionally, the micropipette aspiration technique was used at stretching and creepexperiments so as to calculate the alterations of cell’s Young modulus, E, and apparentviscosity, η. Mean values were increased at the course of spreading for both surfaces,demonstrating greater values on chitosan. The present study is a complete phenomenological approach of the mechanical behaviorof osteoblasts during attachment. Attachment on chitosan is accompanied by alterationsof the mechanical behavior and is associated with critical biochemical processes.

Η κατανόηση των φαινομένων που λαμβάνουν χώρα κατά την αλληλεπίδρασηκυττάρου βιοϋλικού και η συσχέτιση μηχανικών παραμέτρων του κυττάρου μεπολύπλοκες διεργασίες στο εξωκυττάριο (ECM) περιβάλλον οδηγεί το μέλλον στοσχεδιασμό των βιοϋλικών.Σκοπός της διατριβής ήταν η διερεύνηση της προσκόλλησης και των μεταβολών τωνμηχανικών ιδιοτήτων οστεοβλαστών στους αρχικούς χρόνους προσκόλλησης σευπόστρωμα του βιοπολυμερούς χιτοζάνης.Η προετοιμασία υποστρωμάτων χιτοζάνης έγινε με ομοιοπολική πρόσδεση τουβιοπολυμερούς σε επιφάνεια γυαλιού (επιφάνεια ελέγχου). Με φασματοσκοπίαφωτοηλεκτρονίων από ακτίνες Χ επιβεβαιώθηκε η μεταβολή της επιφανειακήςχημικής σύστασης. Η μέση επιφανειακή τραχύτητα, με χρήση ΜικροσκοπίαςΑτομικής Δύναμης, βρέθηκε 4 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε σύγκριση με τογυαλί, ενώ η μέση γωνία διαβροχής ήταν περίπου 3 φορές μεγαλύτερη στη χιτοζάνη. Ο αριθμός και η μέση επιφάνεια εξάπλωσης των προσκολλημένων κυττάρων,προσδιορίστηκαν από φωτογραφίες ηλεκτρονιακού μικροσκοπίου σάρωσης καιχρήση λογισμικού ανάλυσης εικόνας. Μέχρι τα 30 λεπτά, ο αριθμός ήτανμεγαλύτερος στη χιτοζάνη, ενώ μετά τα 45 λεπτά, στο γυαλί. Σε όλους τουςχρόνους, η μέση επιφάνεια εξάπλωσης ήταν μεγαλύτερη στη χιτοζάνη.Για την ποσοτικοποίηση της προσκόλλησης, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική τηςμικροπιπέττας σε πειράματα αποκόλλησης μεμονωμένων οστεοβλαστών.Υπολογίστηκε η “ώθηση αποκόλλησης”, I, ως το ολοκλήρωμα της εφαρμοζόμενηςδύναμης στο χρόνο (I=SFdt) για την πλήρη αποκόλληση ενός κυττάρου και βρέθηκεστατιστικά μεγαλύτερη στη χιτοζάνη σε όλους τους χρόνους. Με την τεχνικήΠοσοτικής Αλυσιδωτής Αντίδρασης Πολυμεράσης, η έκφραση των γονιδίωνιντεγκρινών αν, α4, β1 και β3 βρέθηκε σημαντικά αυξημένη στη χιτοζάνη από τα 30στα 120 λεπτά. Με συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης, παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση της κινάσης εστιακής προσκόλλησης στη χιτοζάνη στα 30 και στα 120λεπτά.Τέλος, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της μικροπιπέττας σε πειράματα εφελκυσμού καιερπυσμού των οστεοβλαστών και υπολογίστηκαν οι μεταβολές του μέτρου Young, Ε,και του φαινόμενου ιξώδους, η. Οι μέσες τιμές βρέθηκαν αυξημένες στην πορεία τηςπροσκόλλησης στις δύο επιφάνειες, παρουσιάζοντας υψηλότερες τιμές στηχιτοζάνη.Η παρούσα διατριβή είναι μια ολοκληρωμένη φαινομενολογική προσέγγιση τηςμηχανικής συμπεριφοράς της οστεοβλάστης κατά την προσκόλληση. Η προσκόλλησηστη χιτοζάνη συνοδεύεται από μεταβολές στη μηχανική συμπεριφορά και συνδέεταιμε κρίσιμες βιοχημικές διεργασίες.