Διερεύνηση μηχανισμών συνδυαστικής δράσης φωτός, φωτοευαίσθητων ουσιών και φυσικών αντιοξειδωτικών σε μοντέλα νεοπλασιών με ανάπτυξη οπτικών μεθόδων

Abstract

Light tissue interactions have been puzzling human kind almost from the very beginning of history. Enormous efforts have been made for developing methodologies, utilizing the advances that light offers, both for diagnostic as well as therapeutic purposes. Among the latter, photodynamic therapy holds the most promising qualities.Photodynamic therapy (PDT) is a minimally invasive, extremely selective modality for treatment of cancerous and non-cancerous diseases. PDT consists of three essential elements, light, photosensitizer (PS), and oxygen, each one individually is non-toxic. PDT involves administration of a PS followed by irradiation at a specific wavelength, corresponding to the PS’s absorption maximum. In the presence of oxygen a series of photochemical reactions are evoked leading to the destruction of the target malignant tissue through direct tumor cell death, damage to the microvasculature, or induction of a local inflammatory reaction. PDT has successfully been used for the treatment of superficial skin tumors. Recently research focuses in the amplification of PDT in solid tumors in internal organs and in the development of methodologies that would enhance the photodynamic efficacy and maximize the therapeutic outcome.The aim of the present thesis was to investigate the mechanisms that govern photodynamic interactions with cancer models (both in vitro and in vivo) and their modulation through adaptation of nanotechological methods and shifting of intracellular redox equilibrium. Implementation of research evolved the optimization of PDT efficacy on solid tumors in internal organs with parallel total elimination of prolonged photosensitivity, the most severe side effect of PDT.More specifically, recent advances in nanotechnology were incorporated for drug encapsulation. Nanotechnology offers the necessary methodology for encapsulation of common PSs in nanocarrier drug systems in order to further improve their pharmacokinetic properties and photodynamic action. In the present thesis the most effective 2nd generation PS, 5,10,15,20- tetrakis(3-hydroxy phenyl) chlorin, m-THPC or Temoporfin encapsulated in a nanocarrier system, the stereochemically stabilized liposomes (PEGylated liposomes) and was studied for its photophysical characteristics and photodynamic properties.The mechanisms of shifting the intracellular redox equilibrium in the pro-oxidant, through the increase of the intracellular reactive oxygen species (ROS), and the suppression of the intracellular antioxidant defense system in order to bend the resistance in photodynamic action, were also studied in cancer models both in vitro and in vivo. PDT action is based on the oxidative stress that is evoked upon the photosensitizer excitation and the consequent activation of cell death mechanisms. Intracellular antioxidant defense systems antagonize the increase in ROS levels in order to preserve cellular integrity and viability. Cell death is inevitable only when the intrinsic oxidative stress and the PDT induced oxidative stress overcome the intracellular antioxidant defense system.Moreover the potentiality of eliminating severe prolonged photosensitivity was also studied. This severe PDT side effect holds its origin in PS molecules that are preserved in the skin and are activated by natural light resulting in photodamage of the healthy tissue. Antioxidant compounds, according to their dose, act engaging ROS or they act as pro-oxidants. Their behavior is also governed by the tissue type, healthy or cancerous. A natural mixture of secondary metabolites, rich in antioxidant properties, was chosen to be studied for its potential to deactivate ROS protecting healthy tissue from photosensitivity.Results from the above mentioned research were thoroughly studied, analyzed and turned into advantage of PDT efficacy optimization.Furthermore, an interstitial photodynamic therapy system was developed in order to treat solid (non-superficial) tumors in internal organs. Light for PS activation was delivered through optical fibers right inside the tumor. This technique reassured that only the PS molecules inside the tumor were excited leaving the surrounding healthy tissue unaffected, preserving both its structure and the organ’s usual functionality. Prostate cancer was chosen as a deep seated tumor model, to test the interstitial photodynamic therapy system and further improve the photodynamic therapy efficacy.The present thesis developed in four axes:Firstly, prostate cancer in vitro and in vivo models were developed. These models preserve phenotypic similarities with human prostate cancer, are essential in the development of therapeutic methodologies and in the study of their mechanisms of action.Hereupon methodologies have been developed to study the photophysical properties and the photodynamic efficiency of the PEGylated liposomal formulated of m-THPC. Results were compared with the corresponding from m-THPC. PS encapsulation in nanocarriers is a resent development in the direction of their pharmacokinetic properties optimization. The superiority of the PEGylated liposomal m-THPC was raised both on the photophysical properties and the photodynamic activity, implying that less PS dose was needed to cause cells death.For the interstitial photodynamic therapy in the prostate cancer animal model a system for interstitial illumination was developed. Light for the activation of the PS was delivered through that system inside the tumor boundaries. The system composed of a diode laser with adjustable output power up to . A bare tip optical fiber was connected to the laser system and thus light was delivered into the tumor. By using a digital imaging system, consisting of a CCD camera, stereotactic devices and appropriate software, treatment outcome was monitored. IPDT with the PEGylated liposomal m-THPC succeeded in total elimination of the tumor, in the prostate cancer animal model. Results gave evidence that IPDT with the PEGylated liposomal m-THPC could be amplified in clinical studies for the treatment of prostate cancer.Research regarding the improvement of photodynamic efficacy with concomitant removable of photosensitivity followed. Two methodologies were developed in this direction, with common aim, the alteration of intracellular redox potential in favor of PDT.Firstly, intracellular antioxidant defense system was suppressed utilizing the inhibitor of glutathione synthesis L-buthionine sulfoximine (BSO). The combined action of BSO with PDT has not been thoroughly studied, although it has been extensively used to moderate the organism resistance in anticancer therapies. Till now there have been no results of other researchers concerning the combined effect of PDT-BSO in prostate cancer. In the present thesis the potential synergistic effect of BSO with PDT was studied in a prostate cancer model in vitro. The results have shown that the effect was depended on BSO dose. Lower doses resulted in an antagonistic effect while higher doses improved the PDT efficacy, resulting in higher levels of cells death, providing evidence of synergy.The second methodology, regarding manipulation of intracellular redox state, involved administration of an antioxidant agent, a mixture of secondary metabolites rich in polyphenolic compounds. Those mixtures, in relatively low doses act as antioxidants, detoxifying ROS while in relative high doses they act as pro-oxidants. In the present thesis a mixture of polyphenolic compounds from P.halepensis bark extract was studied for its potential synergy with PDT, both in vitro and in vivo. Results revealed strong evidence of synergy in the in vitro model of prostate cancer. IPDT with the mixture of polyphenolic compounds from P.halepensis bark extract in the animal model of prostate cancer preserved the therapeutic outcome of IPDT while totally eliminated photosensitivity.The optimization of the pharmacokinetic properties of the PS, by their encapsulation in nanocarriers, as well as the exploration of whether this technique truly contributed to the enhancement of the photodynamic efficacy puzzles researchers. In the present study, the superiority of the PEGylated liposomal m-THPC over m-THPC, regarding photodynamic efficacy, was proven. The results of the abovementioned studies were processed theoretically and statistically, and compared with the results of relevant studies in the literature.The present thesis contributes in the improvement of interstitial photodynamic therapy of prostate cancer by importing encapsulated in nanocarriers PS.Among the severe side effects and defects that PDT has to overcome in order to be wider approved and used is prolonged photosensitivity. Up to now, there has never been proposed any methodology that could successfully treat this side effect. Research in the present thesis showed that a natural mixture of polyphenolic compounds preserved PDT efficacy while totally eliminated prolonged photosensitivity. Therefore, the present research contributes in the improvement of the photodynamic efficacy and in the total elimination of prolonged photosensitivity through the administration of a mixture of polyphenolic compounds. This result is worldwide original as, up to now, there hasn’t been any other report referring to both total elimination of cancer tumor and removal of photosensitivity. The removal of prolonged photosensitivity through the administration of the mixture of natural polyphenolic compounds significantly contributes in the wider acceptance and utilization of PDT.The results provide, finally, new insight towards understanding of the mechanisms by which agents modulate intracellular redox equilibrium. The results of the present thesis are original and, besides improvement of the photodynamic therapy efficacy, they could be exploited to the improvement of other anticancer therapies, like chemotherapy, that act though oxidative stress mechanisms..

Οι αλληλεπιδράσεις του φωτός με βιολογικούς ιστούς, η κατανόηση των μηχανισμών που τις διέπουν και η δυνατότητα αξιοποίησης αυτών για διαγνωστικούς ή και θεραπευτικούς σκοπούς απασχολεί την ανθρωπότητα σχεδόν από την απαρχή της ιστορίας. Τα τελευταία χρόνια συστηματική έρευνα διεξάγεται στην κατεύθυνση τόσον της διάγνωσης, αναπτύσσοντας τεχνολογίες «οπτικής βιοψίας», όσον και στην κατεύθυνση της θεραπείας νεοπλασιών και μη καρκινικών αλλοιώσεων. Κυρίαρχο ρόλο στις μεθοδολογίες θεραπείας, μέσω της αξιοποίησης των δυνατοτήτων του φωτός, κατέχει η φωτοδυναμική θεραπεία. Σκοπό της παρούσας διατριβής απετέλεσε η διερεύνηση των μηχανισμών δράσης φωτός και φωτοευαίσθητων ουσιών με μοντέλα νεοπλασιών, όπως αυτοί τροποποιούνται με την εισαγωγή μεθόδων νανοτεχνολογίας και αξιοποίηση της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Εφαρμογή της έρευνας απετέλεσε η βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής δράσης σε καρκινικούς όγκους τριών διαστάσεων εν τω βάθει, με παράλληλη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας, της σοβαρότερης παρενέργειας της φωτοδυναμικής θεραπείας. Αξιοποιήθηκε η πλέον πρόσφατη τεχνολογική εξέλιξη, στην τομή νανοτεχνολογίας - φωτοδυναμικής, ο εγκλεισμός φωτοευαισθητοποιητών σε νανοσωματίδια. Διερευνήθηκαν οι μηχανισμοί τροποποίησης της συγκέντρωσης των ενδοκυττάριων ελευθέρων ριζών και δραστικών οξυγονούχων ειδών, σε μοντέλα νεοπλασιών, τόσο σε επίπεδο κυττάρου όσον και σε πειραματόζωα, με σκοπό την αύξηση της ενδοκυττάριας συγκέντρωσης των ελευθέρων ριζών και δραστικών οξυγονούχων ειδών και την καταστολή της ενδοκυττάριας αντιοξειδωτικής άμυνας ώστε να καμφθεί ο ανταγωνισμός που δέχεται η φωτοδυναμική και να ενισχυθεί η δράση της. Διερευνήθηκε η δυνατότητα άρσης της παραμένουσας φωτοευαισθησίας. Προκειμένου να επεκταθεί η εφαρμογή της φωτοδυναμικής θεραπείας σε μη επιφανειακούς καρκινικούς όγκους σε εσωτερικά όργανα του σώματος τέθηκε ως στόχος η ανάπτυξη συστήματος ενδοϊστικής φωτοδυναμικής ακτινοβόλησης. Η παρούσα διατριβή αναπτύχθηκε σε τέσσερις άξονες:Αρχικά ανεπτύχθησαν μοντέλα καρκίνου του προστάτη τόσο σε επίπεδο κυττάρου (in vitro) όσο και σε επίπεδο μυός (in vivo). Τα μοντέλα αυτά είναι απαραίτητα για τη μελέτη των μηχανισμών δράσης αλλά και για την ανάπτυξη μεθοδολογιών θεραπείας της νόσου. Τα μοντέλα σε επίπεδο κυττάρου επιτρέπουν τη μελέτη των επιδράσεων διαφόρων ερεθισμάτων, ακόμα και σε μοριακό επίπεδο, διευκολύνοντας την εις βάθος κατανόηση των μηχανισμών δράσης διαφόρων παραγόντων. Τα μοντέλα πειραματοζώων είναι ιδιαιτέρως σημαντικά καθώς εξασφαλίζουν την ανάπτυξη καρκινικών όγκων οι οποίοι φαινοτυπικά παρουσιάζουν σημαντικές ομοιότητες με τους καρκινικούς όγκους που απαντώνται στον άνθρωπο και επιτρέπουν την ανάπτυξη θεραπευτικών σχημάτων. Ακολούθως ανεπτύχθησαν μεθοδολογίες και μελετήθηκαν οι φωτοφυσικές ιδιότητες και η φωτοδυναμική δράση της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC οι οποίες συγκρίθηκαν με τις αντίστοιχες της ελεύθερης m-THPC. Ο εγκλεισμός φωτοευαισθητοποιητών σε νανοσωματίδια είναι πρόσφατη εξέλιξη στην κατεύθυνση της βελτιστοποίησης των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων των μορίων αυτών. Διαπιστώθηκε η υπεροχή της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC έναντι της ελεύθερης τόσο ως προς τις φωτοφυσικές ιδιότητες όσο και ως προς τη φωτοδυναμική δράση, γεγονός που επιτρέπει τη χορήγηση μικρότερων ποσοτήτων φωτοευαισθητοποιητή για την πρόκληση κυτταρικού θανάτου. Για την ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη αναπτύχθηκε σύστημα ενδοϊστικής ακτινοβόλησης. Μέσω του συστήματος αυτού γινόταν η μεταφορά του φωτός διέγερσης μέσα στον καρκινικό όγκο με τρόπο τέτοιο ώστε να καλύπτεται όλη η έκταση του καρκινικού όγκου, χωρίς να εκτείνεται εκτός των ορίων αυτού. Το σύστημα αποτελείτο από διοδικό laser στα 652 nm με ισχύ εξόδου έως 2 W στο οποίο συνδεόταν οπτική ίνα με γυμνό ακροδέκτη για τη μεταφορά του φωτός μέσα στον καρκινικό όγκο. Παράλληλα, μέσω απεικονιστικού συστήματος αποτελούμενου από CCD κάμερα με κατάλληλη διάταξη φωτισμού προσαρτημένων σε στερεοτακτική διάταξη καταγραφόταν η απόκριση των καρκινικών όγκων στη θεραπεία. Διαπιστώθηκε πως ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία με την εγκλεισμένη σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC μπορεί να θεραπεύσει πλήρως τον καρκινικό όγκο στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη. Η παρατήρηση αυτή, σε συνδυασμό με την υπεροχή της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC και σε επίπεδο κυττάρου, συνηγορούν στην επέκταση των μελετών ενδοϊστικής φωτοδυναμικής θεραπείας με την εγκλεισμένη λιποσωμιακή m-THPC σε κλινικό επίπεδο για τη θεραπεία καρκίνου του προστάτη.Εν συνεχεία διερευνήθηκε η βελτιστοποίηση των αποτελεσμάτων της φωτοδυναμικής δράσης και η ταυτόχρονη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας, η οποία αποτελεί το σοβαρότερο πρόβλημα της φωτοδυναμικής θεραπείας. Ανεπτύχθησαν δυο προσεγγίσεις με στόχο κοινό, τη μεταβολή της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας. Η πρώτη προσέγγιση αφορούσε τη ρήξη της ενδοκυττάριας αντιοξειδωτικής άμυνας μέσω χορήγησης του αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης, L-buthionine sulfoximine (BSO). Μολονότι ο παράγοντας BSO χρησιμοποιείται για να κάψει την αντίσταση του οργανισμού στις αντικαρκινικές θεραπείες (π.χ. χημειοθεραπεία) και υπάρχουν δεδομένα τα οποία υποστηρίζουν ότι πράγματι ενισχύει την αποτελεσματικότητα των θεραπειών, η δράση του σε συνδυασμό με τη φωτοδυναμική δεν έχει μελετηθεί διεξοδικά. Απουσιάζουν δε από τη βιβλιογραφία μελέτες της συνδυασμένης δράσης της φωτοδυναμικής με τον αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης στην περίπτωση καρκίνου του προστάτη. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε η πιθανότητα συνέργειας του αναστολέα της βιοσύνθεσης της γλουταθειόνης (BSO) με τη φωτοδυναμική θεραπεία σε επίπεδο μοντέλου κυττάρου καρκίνου του προστάτη. Ο παράγοντας BSO, ανάλογα με τη συγκέντρωση χορήγησης, έδρασε σε ορισμένες περιπτώσεις ανταγωνιστικά ως προς τη φωτοδυναμική, ενώ σε υψηλές συγκεντρώσεις ενίσχυσε τη φωτοδυναμική δράση. Η δεύτερη προσέγγιση, στην κατεύθυνση τροποποίησης της ενδοκυττάριας οξειδοαναγωγικής ισορροπίας, αφορούσε στη χορήγηση φυσικού μείγματος δευτερογενών μεταβολιτών με πλούσιες αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Τα μείγματα αυτά σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις δρουν αντιοξειδωτικά, δεσμεύοντας ελεύθερες ρίζες και δραστικά οξυγονούχα είδη. Σε μεγαλύτερες ωστόσο συγκεντρώσεις η δράση τους είναι προ-οξειδωτική. Ισχυρή αντιοξειδωτική / προ-οξειδωτική δράση παρουσιάζουν φυσικά μείγματα πολυφαινολών προερχόμενα από συστατικά φυτών. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής διερευνήθηκε και καθορίστηκε ότι μείγμα πολυφαινολών προερχόμενο από φλοιό πεύκου P.halepepsis παρουσίαζε ισχυρή αντιοξειδωτική δράση και στη συνέχεια ήταν αυτό το οποίο ελέγχθηκε σε συνδυασμό με τη φωτοδυναμική. Στο μοντέλο κυττάρου καρκίνου του προστάτη το φυσικό μείγμα πολυφαινολών έδρασε σε συνέργεια με τη φωτοδυναμική, σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις, ενισχύοντας τη δράση της. Σε συνδυασμό με την ενδοϊστική φωτοδυναμική θεραπεία στο μοντέλο μυός καρκίνου του προστάτη κατόρθωσε να διατηρήσει τη θεραπευτική δράση της ενδοϊστικής φωτοδυναμικής αίροντας πλήρως την παραμένουσα φωτοευαισθησία. Το ζήτημα της βελτίωσης των φαρμακοκινητικών ιδιοτήτων των φωτοευαισθητοποιητών μέσω του εγκλεισμού τους σε νανοσωματίδια και η διερεύνηση του αν όντως ενισχύουν τη φωτοδυναμική δράση είναι από αυτά που προβληματίζουν εντονότερα την επιστημονική κοινότητα. Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ανεδείχθη η υπεροχή της φωτοδυναμικής δράσης της εγκλεισμένης σε στερεοχημικά σταθεροποιημένα λιποσώματα m-THPC σε σύγκριση με την ελεύθερη m-THPC. Τα αποτελέσματα της έρευνας επεξεργάστηκαν τόσο θεωρητικά όσον και στατιστικά και έγινε συγκριτική αντιπαράθεση με αντίστοιχα δεδομένα της βιβλιογραφίας. Η παρούσα διατριβή συνεισφέρει στη βελτιστοποίηση της ενδοϊστικής φωτοδυναμικής θεραπείας καρκίνου του προστάτη εισάγοντας την τεχνολογία εγκλεισμένων σε νανοσωματίδια φωτοευαισθητοποιητών.Από τα σοβαρότερα προβλήματα τα οποία η φωτοδυναμική θεραπεία καλείται να αντιπαλέψει επιτυχώς για να γίνει ευρύτερα αποδεκτή είναι η παραμένουσα φωτοευαισθησία. Έως τώρα δεν έχει διατυπωθεί επιτυχής μεθοδολογία αντιμετώπισης του προβλήματος. Οι μελέτες στα πλαίσια της παρούσας διατριβής ανέδειξαν πως φυσικό μείγμα πολυφαινολών διατήρησε τη δράση της φωτοδυναμικής αίροντας πλήρως την παραμένουσα φωτοευαισθησία. Επομένως, η παρούσα διατριβή συνεισφέρει στη βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής δράσης και στην άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας μέσω της χορήγησης φυσικού μείγματος πολυφαινολών. Το αποτέλεσμα είναι διεθνώς πρωτότυπο καθώς δεν υπάρχει αναφορά άλλη στην οποία να παρουσιάζεται θεραπεία του καρκινικού όγκου με παράλληλη άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας. Η άρση της παραμένουσας φωτοευαισθησίας μέσω της χορήγησης του φυσικού μείγματος πολυφαινολών θα συμβάλλει σημαντικά στην ευρύτερη αποδοχή της φωτοδυναμικής θεραπείας. Παρέχει, τέλος, νέα δεδομένα στην κατανόηση των μηχανισμών δράσης παραγόντων που τροποποιούν την ενδοκυττάρια οξειδοαναγωγική ισορροπία. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής είναι διεθνώς πρωτότυπα ενώ πέρα από τη βελτιστοποίηση της φωτοδυναμικής μπορούν να αξιοποιηθούν και σε άλλες αντικαρκινικές θεραπείες που δρουν μέσω οξειδωτικού στρες.